1.??????注意：冰上處理（切組織可以在干冰上進行）。

2.??????30mg心肌組織放至勻漿管。

3.??????剪碎。

4.??????加入磁珠5-6顆。

5.??????加入RIPA+Cocktail?（每10ml RIPA里加入一粒Cocktail），每管1000μl。

6.??????勻漿機：6500 rpm, 30-40s。

7.??????冰上靜止30min。

8.??????13000rpm 4℃離心10min。

9.??????勻漿轉(zhuǎn)移至EP管（用移液槍，盡量吸150μl以上）。

10.???BCA測濃度（96孔板）

? ? ? ? 1)?反應(yīng)液的制備：B液：A液=50:1，每個孔加200μl（總量=（樣本數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)）×復(fù)孔數(shù)×200μl）

? ? ? ? 2)?樣品與標(biāo)準(zhǔn)品：樣品（稀釋50倍）：2μl樣品+18μl RIPA；標(biāo)準(zhǔn)品（可用8連管，做2個重復(fù)）：?50ul標(biāo)準(zhǔn)品?，20ulPBS，20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS?（8個濃度梯度）

? ? ? ? 3)?恒溫箱：37℃，30min

? ? ? ? 4)?酶標(biāo)儀：562nm

? ? ? ? 5)?Excel：A.?標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各樣本濃度，乘以10得到蛋白原液的濃度；?B.計算Reducing(10x)?& Loading Buffer (4x)? &?RIPA的體積：先設(shè)定最終體系為1ug/ul或者2ug/ul，150ul。

11.? ?濃度歸一化：配制混合液（Reducing,?Loading Buffer, RIPA和蛋白原液）。

12.???變性：70℃，15min。

13.???保存：-80℃。

上述文字可結(jié)合視頻：?

蛋白質(zhì)提取：https://www.bilibili.com/video/BV1K64y167hk/

BCA法測蛋白濃度：?https://www.bilibili.com/video/BV1wq4y1s7gN/

WB 蛋白濃度歸一化：https://www.bilibili.com/video/BV1og411j7Ce/