前言

B 細(xì)胞具有產(chǎn)生針對多種靶標(biāo)的抗體的獨(dú)特能力，可提供針對感染的保護(hù)，同時(shí)還有助于免疫失調(diào)環(huán)境中的發(fā)病機(jī)制。人類 B 細(xì)胞分為五個(gè)群體：過渡、幼稚、非轉(zhuǎn)換記憶、轉(zhuǎn)換記憶和漿細(xì)胞。識別和分類人類 B 細(xì)胞的功能亞群，阻礙了作者在自身免疫中選擇性靶向致病性 B 細(xì)胞和在疫苗接種中誘導(dǎo)記憶反應(yīng)的能力。

為了表征外圍成熟的人類 B 細(xì)胞，本文作者開發(fā)了一種高度復(fù)用的單細(xì)胞篩選方案，通過使用大規(guī)模細(xì)胞術(shù)來量化 351 個(gè)表面分子的共表達(dá)。基于作者的研究結(jié)果，作者提出了一種分類方案，將來自外周血、骨髓、淋巴結(jié)和扁桃體四個(gè)組織的的 B 細(xì)胞分為 12 個(gè)獨(dú)特的亞組，并構(gòu)建了具有表面表型、代謝、生物合成活性和對免疫激活的信號反應(yīng)特征的廣泛單細(xì)胞圖譜。這個(gè)人類 B 細(xì)胞身份圖譜將使研究能夠在穩(wěn)態(tài)、疫苗接種、感染、自身免疫和癌癥的背景下進(jìn)一步確定 B 細(xì)胞亞群的功能。

本篇為斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)在 Immunity期刊（IF:43.474）發(fā)表的題為 “An Integrated Multi-omic Single-Cell Atlas of Human B Cell Identity”的研究成果，采用改進(jìn)的質(zhì)譜流式細(xì)胞儀、流式細(xì)胞術(shù)等研究方法，成功量化了百萬級人類B 細(xì)胞上 351 種表面分子的共表達(dá)模式。通過鑒定了差異表達(dá)的分子，對比VDJ 序列、代謝譜、生物合成活性和信號反應(yīng)。提出了新的 B 細(xì)胞分類方案：在四種淋巴組織中鑒定出 12 個(gè)獨(dú)特的亞群，包括 CD45RB + CD27 -早期記憶群體、類別轉(zhuǎn)換的 CD39 +扁桃體常駐群體和有效響應(yīng)免疫激活的 CD19 hi CD11c +記憶群體。該分類框架和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集為進(jìn)一步研究人類 B 細(xì)胞身份和功能提供了資源。

技術(shù)流程

研究結(jié)果

1.高度多重的單細(xì)胞表面篩選揭示了人類 B 細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組

為了識別區(qū)分 B 細(xì)胞亞群的分子，作者開發(fā)了多重篩選的方法，并量化了健康人類 B 細(xì)胞上 351 種表面抗原上的共表達(dá)模式（圖1A）。通過設(shè)計(jì)了 12 個(gè)質(zhì)譜抗體組，每個(gè)組由 9 個(gè)用于子集的保守分子和 30 個(gè)對每個(gè)組獨(dú)特的可變分子組成。門策略可以實(shí)現(xiàn)四個(gè)典型 B 細(xì)胞亞群：過渡、幼稚、非轉(zhuǎn)換記憶和轉(zhuǎn)換記憶（圖1B）。在設(shè)置了一個(gè)嚴(yán)格的閾值（圖 1 C）后，作者確定了 98 個(gè)在人類 B 細(xì)胞上表達(dá)的表面分子（圖 1D)。作者的單細(xì)胞篩選策略實(shí)現(xiàn)了對人類 B 細(xì)胞表達(dá)的表面分子的可靠鑒定。

圖1 |高度多重的單細(xì)胞表面篩選揭示了人類 B 細(xì)胞表面蛋白質(zhì)組

a)實(shí)驗(yàn)概述 (n = 2 個(gè)捐助者)。

b)典型種群的代表性門控。

c)屏幕上分子陽性的代表性閾值。

d)總 B 細(xì)胞（頂行）的百分比陽性和 B 細(xì)胞表達(dá)的分子子集（底行）的中值表達(dá)。

2.差異表達(dá)分析揭示了幼稚 B 細(xì)胞的無反應(yīng)特性

通過規(guī)范門控策略識別組織B 細(xì)胞的成熟狀態(tài)：從過渡到幼稚、非切換和切換記憶。為了探究在整個(gè)過程中發(fā)生的蛋白質(zhì)組學(xué)變化，作者評估了所有分子的子集中每個(gè)成對組合之間的表達(dá)差異。作者繪制了 61 個(gè)差異表達(dá)分子（圖2A ）。

正如預(yù)期的那樣，未成熟的同種型 IgD 和 IgM 在過渡和幼稚亞型中富集，而經(jīng)典記憶分子 CD27 在記憶細(xì)胞中富集。CD305在抗原缺乏經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞中比記憶細(xì)胞富集， CD45RB (RB) 是 CD45 的同種型，優(yōu)先在記憶細(xì)胞中表達(dá)。作者繪制了幼稚細(xì)胞與其他子集的比較（圖2B），作者發(fā)現(xiàn)幼稚細(xì)胞表達(dá)的與運(yùn)輸相關(guān)的分子數(shù)量少于任何其他子集，這表明它們對刺激的反應(yīng)較小。事實(shí)上，幼稚細(xì)胞對 16 種轉(zhuǎn)運(yùn)分子的中位表達(dá)值最低，在所有 46 種轉(zhuǎn)運(yùn)分子中平均表達(dá)最低（圖 2C）。作者探索了這種趨勢在 GO 術(shù)語中是否一致，并發(fā)現(xiàn)幼稚細(xì)胞在 30 個(gè)術(shù)語中的 19 個(gè)具有最低的平均表達(dá)值（圖 2 D）。事實(shí)上，當(dāng)對所有 98 個(gè)分子的中位表達(dá)值進(jìn)行平均時(shí)，幼稚細(xì)胞的平均值最低，這表明它們比其他 B 細(xì)胞亞群處于更無反應(yīng)的狀態(tài)。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了幼稚 B 細(xì)胞的無反應(yīng)特性。

圖2 |?差異表達(dá)分析揭示幼稚 B 細(xì)胞

a)子集的每個(gè)成對比較的中值表達(dá)差異。所有非白色瓷磚都是顯著的（p < 0.005）。

b)比較的火山圖，與 GO 術(shù)語“運(yùn)輸”相關(guān)聯(lián)?？蛑辛谐龅娘@著不同的分子按表達(dá)差異幅度的遞減排序。

c)轉(zhuǎn)運(yùn)分子 (顏色) 的中值表達(dá)。所有轉(zhuǎn)運(yùn)分子的中位表達(dá)平均值（黑色）。

d)與 GO 術(shù)語相關(guān)的分子的中值表達(dá)平均值 (顏色)。所有分子的中值表達(dá)的平均值（黑色）。

e)在幼稚細(xì)胞中表達(dá)更高的六種分子的表達(dá) (p < 0.005)。

3.CD45RB 標(biāo)記人類記憶 B 細(xì)胞并識別早期記憶群體

為了找到唯一識別不同 B 細(xì)胞的標(biāo)記，作者以無偏方式分析了所有 B 細(xì)胞中分子的共表達(dá)模式。作者生成了統(tǒng)一UMAP圖，通過使用所有 12 個(gè)試管的供體匯集數(shù)據(jù)來展示保守分子的表達(dá)（圖 3A）。作者繪制了與保守分子相關(guān)的分子，并按功能和相關(guān)保守標(biāo)記進(jìn)行展示（圖 3 B）。

在 UMAP 坐標(biāo)上疊加規(guī)范門控標(biāo)簽，盡管表型相似，但細(xì)胞被規(guī)范門控視為不同的子集（圖 3C）。大多數(shù) CD27 +細(xì)胞也是 RB +，而 RB + CD27-群體包含 25% 未封閉的細(xì)胞（圖 3 D 和 3E）。鑒于 RB + CD27 -細(xì)胞和 CD27 +細(xì)胞在 UMAP 上的共定位，作者假設(shè)這些細(xì)胞代表在當(dāng)前分類方案下未被識別的記憶細(xì)胞群。

為了評估 RB 和 CD27的記憶細(xì)胞譜，作者前瞻性地從健康的人類 B 細(xì)胞（n = 2 個(gè)供體）中分離出 CD27 × RB雙陽細(xì)胞，并通過下一代測序?qū)?IgH 基因座進(jìn)行測序（圖 3 F）。作為抗原暴露的代表，作者測量了互補(bǔ)決定區(qū) 3 (CDR3) 之外的 IgH 基因座中核苷酸的供體匯集突變頻率（圖 3 G）。正如預(yù)期的那樣，CD27 +細(xì)胞具有相對較高的突變負(fù)擔(dān)，在接觸抗原后通過體細(xì)胞超突變 (SHM) 獲得。作者量化了四個(gè)種群在一系列多樣性順序中的多樣性并發(fā)現(xiàn) RB - CD27 -細(xì)胞的多樣性最高，而 RB + CD27 +細(xì)胞的多樣性最低（圖 3 H）。

作者進(jìn)一步探索來自一個(gè)群體的細(xì)胞是否傾向于與來自任何其他群體的細(xì)胞克隆相關(guān)（圖 3 I）。作者發(fā)現(xiàn)來自四個(gè)群體中的每一個(gè)的細(xì)胞都更有可能與來自同一群體的細(xì)胞共享克隆譜系，而不是來自不同群體的細(xì)胞（圖 3J)。這表明 RB 和 CD27 的表達(dá)在克隆譜系中是高度協(xié)調(diào)的，正如對響應(yīng)抗原結(jié)合而表達(dá)的兩種分子所預(yù)期的那樣?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明 RB 的表達(dá)是外周血記憶 B 細(xì)胞的指示，并且與 CD27 的缺失相結(jié)合，可用于對早期記憶群體進(jìn)行分類。

圖3 |? CD45RB 標(biāo)記人類記憶 B 細(xì)胞并識別早期記憶群體

4. 將 B 細(xì)胞分為表型和同型不同的亞群

系統(tǒng)篩選了數(shù)十種在 B 細(xì)胞中差異表達(dá)的分子，因此作者假設(shè)作者可以將 B 細(xì)胞分類為更細(xì)粒度的亞群。作者對新鮮、健康的人類外周血 B 細(xì)胞（n = 3 名供體）進(jìn)行了染色，細(xì)胞降維成十個(gè)不同的群體，包括兩個(gè)幼稚和六個(gè)記憶子集（圖 4 B）。表面表達(dá)譜提示成熟順序排列（圖4B）。七種不同分子的特征表達(dá)以手動門控每個(gè)群體，因此也用于標(biāo)記該方案中的群體：CD11c、CD73、CD95、CD27、CD38、RB 和 CD19（圖 4 C D）。子集傾向于在圖上形成獨(dú)特的島嶼，為作者的分類方法提供正交驗(yàn)證 （圖 4 D）。

為了評估子集之間的表型相似性，作者計(jì)算了中值表達(dá)譜之間的成對歐幾里得距離（圖 4 E）。對于每個(gè)群體，作者量化了表型最相似的子集。RB + CD27 -記憶和 RB + CD27 + CD73 -彼此最相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了 RB + CD27 -細(xì)胞作為記憶子集的狀態(tài)。在匯總數(shù)據(jù)（圖 4 F）中， 組織 B 細(xì)胞也會導(dǎo)致跨個(gè)體供體存在同種型。通過規(guī)范門控，30% 的 IgG +細(xì)胞和 20% 的 IgA +細(xì)胞由于缺乏 CD27，這表明 CD27 單獨(dú)作為記憶分子的不足（圖 4 G）。相比之下，作者的方法正確地將超過 99% 的 IgG +和 98% 的 IgA +細(xì)胞分類為記憶細(xì)胞。

已知 Ig 同種型的使用會影響下游效應(yīng)器功能和分化模式。因此，作者還在同種型的基礎(chǔ)上組織了 B 細(xì)胞，并觀察到BCR 復(fù)合物的兩種成分的不同表達(dá)模式：表面 Ig 和 CD79b（圖4H）。

鑒于這些趨勢，作者探索表型或同種型是否對預(yù)測表面 Ig 和 CD79b 的表達(dá)量貢獻(xiàn)更大。作者創(chuàng)建了單細(xì)胞多元線性回歸模型，其中細(xì)胞的表型標(biāo)記和同型標(biāo)記用于預(yù)測 CD79b 或表面 Ig 的表達(dá)（圖4H）。盡管兩者都提供了豐富的信息，但細(xì)胞的同種型對預(yù)測兩種分子的表達(dá)的貢獻(xiàn)超過了細(xì)胞的表型?？偠灾@些發(fā)現(xiàn)表明，作者的高維分類將外周血 B 細(xì)胞組織成十個(gè)表型不同的亞群，比典型的門控策略更準(zhǔn)確地劃分細(xì)胞。此外，這些表型分區(qū)顯示出同型限制，這進(jìn)一步有助于 B 細(xì)胞的身份。

圖4 |? 將 B 細(xì)胞分為表型和同型不同的亞群

5. B 細(xì)胞亞群功能的研究提示了不同的代謝、生物合成和免疫信號活性特征

為了研究作者改進(jìn)的 B 細(xì)胞分類方案的功能特性，作者探索表面蛋白是否表示其他潛在功能細(xì)胞過程的差異。作者對來自其他供體（n = 9 個(gè)供體）的健康人外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 進(jìn)行了染色，并使用質(zhì)譜儀組來探索 B 細(xì)胞代謝譜、生物合成活性和免疫信號傳導(dǎo)特征（圖 5A）。

作者量化了與四種代謝途徑相關(guān)的八種酶的表達(dá)：糖酵解或發(fā)酵、ATP 感應(yīng)、氧化磷酸化和脂肪酸氧化 (圖5B )。幼稚細(xì)胞在所有亞群中的表達(dá)最低，而 RB + CD27 -記憶細(xì)胞具有介于幼稚和記憶亞群之間的中間代謝特征。這些通路使用的差異可能是由于不同的功能作用，因此不同的代謝需求。

通過將 5-溴尿苷 (BRU) 和嘌呤霉素標(biāo)記與質(zhì)譜儀相結(jié)合，量化從頭RNA 和蛋白質(zhì)合成以及功能和表型特征。作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活動幾乎不能解釋在翻譯活動中觀察到的差異 (圖 5 C)，突出了這兩個(gè)過程的差異調(diào)節(jié)。CD19 hi CD11c +記憶細(xì)胞具有最高的中位轉(zhuǎn)錄活性，其次是 CD73 +幼稚細(xì)胞，其具有最低的中位翻譯活性（圖 5D)。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性漿細(xì)胞中的翻譯活性和 CD184 表達(dá)高于轉(zhuǎn)錄lo漿細(xì)胞（圖 5E)。這種轉(zhuǎn)錄活躍的群體可能是長壽命的漿細(xì)胞，而轉(zhuǎn)錄不活躍的群體可能是短壽命的漿細(xì)胞。

為了評估亞群之間免疫激活敏感性的差異，作者用不同劑量的 BCR 交聯(lián)劑和 CD40 配體刺激 B 細(xì)胞 10 分鐘，然后用包含抗B 細(xì)胞信號傳導(dǎo)固有的磷酸化靶標(biāo)（圖 5A）。作者測量了脾酪氨酸激酶 (pSYK) 和下游磷脂酶 Cγ2 (pPLCγ2) 的磷酸化（圖 5F）。

作者在雙軸等高線圖上可視化了 BCR 復(fù)合信號級聯(lián)中兩個(gè)分子 SYK 和 PLCγ2 的磷酸化狀態(tài)變化，并發(fā)現(xiàn)子集之間的分布變化存在鮮明對比（圖 5 H）。為了量化信號響應(yīng)，作者計(jì)算了推土機(jī)在基線細(xì)胞和受刺激細(xì)胞之間的距離，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)記憶群體以及漿細(xì)胞比所有其他子集的響應(yīng)性明顯更高（圖 5 I）。作者量化了表型和同種型使用的相對貢獻(xiàn)，以預(yù)測代謝途徑表達(dá)、生物合成活性和信號響應(yīng)的表達(dá)（圖 5J)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明作者的表型分類捕獲了代謝途徑使用、生物合成活性和對免疫激活的信號反應(yīng)的功能差異。

圖5 |? B 細(xì)胞亞群功能的研究揭示了不同的代謝、生物合成和免疫信號活性

a)實(shí)驗(yàn)工作流程 (n = 9 捐助者)。

6. 淋巴組織特異性 B 細(xì)胞群的表征

為了將人類 B 細(xì)胞分析的范圍擴(kuò)大到外周血之外，作者分析了來自外周血的骨髓 (n = 3)、扁桃體 (n = 3)、淋巴結(jié) (n = 1) 和其他外周血樣本 (n = 4)一個(gè)新的健康捐贈者隊(duì)列（n = 11），通過大規(guī)模細(xì)胞術(shù)（圖 6A）。為了探索組織之間 B 細(xì)胞表達(dá)的整體差異，作者評估了所有分子的供體組織表達(dá)差異。作者確定了至少一對組織之間存在差異表達(dá) (p < 0.005) 的 21 個(gè)分子，并繪制了它們的分布，按功能組織（圖 6 B）。淋巴結(jié)也明顯偏向未成熟同種型（圖 6 C）。然而，扁桃體沒有富集任何抑制分子（圖 6 B），主要由具有記憶表型的細(xì)胞組成（圖 6 C 和4 G）。

為了評估組織內(nèi) B 細(xì)胞表型的組成，作者繪制了子集比例圖，并且根據(jù)同種型數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)大量富含 CD73 +幼稚細(xì)胞（圖 6 D）。為了評估組織的差異性，作者根據(jù)子集組成計(jì)算了每個(gè)組織之間的成對曼哈頓距離（圖 6 E）。

作者確定了外周血中不存在的兩個(gè)亞群：生發(fā)中心 (GC) B 細(xì)胞，存在于扁桃體和淋巴結(jié)中，以及一個(gè) CD39 +扁桃體群（圖 6 D)。GC 細(xì)胞是 CD38 +和 CD32 - (圖 6 F)。

圖6 |? 淋巴組織特異性 B 細(xì)胞群的表征

a)實(shí)驗(yàn)工作流程 (n = 11 捐助者)。

b)分子的小提琴圖在至少兩種組織中顯著差異表達(dá) (p < 0.005)。

研究討論

為了探究原代細(xì)胞的深層表型多樣性，作者開發(fā)了一種高度多重的單細(xì)胞表面篩選，并將其應(yīng)用于識別可以分離人類 B 細(xì)胞亞群的分子。這種方法使作者能夠區(qū)分四種淋巴組織中的 12 個(gè) B 細(xì)胞亞群并關(guān)聯(lián)它們的功能特征。

作者確定了六個(gè)記憶群體，證實(shí)了先前關(guān)于小鼠和人類抗原識別后表型多樣化的報(bào)道。作者還確定了一個(gè) CD19 hi CD11c +記憶群體，它與在自身免疫、感染和衰老背景下描述的幾個(gè)群體具有一些共同特征?？▋?nèi)爾等人，2017）。在這個(gè)群體中，作者通過 CD27 表達(dá)分離細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) T-bet 和 PD-1 在 CD27 - CD19 hi CD11c +記憶細(xì)胞中富集，類似于在 T 細(xì)胞中看到的效應(yīng)記憶表型。

在這里，作者通過對健康個(gè)體中多組學(xué)整合進(jìn)行的深度表型分析揭示了新的、更細(xì)的B群體確定，全面映射了人體血液和淋巴組織中的 B 細(xì)胞身份。對幾個(gè)細(xì)胞過程中表型與同種型使用的貢獻(xiàn)的定量評估突出了對超越譜測序和同種型身份進(jìn)行分析以了解人類 B 細(xì)胞免疫功能的必要性。研究結(jié)果作為未來研究在疫苗接種或疾病背景下研究體液免疫反應(yīng)的資源，描述的群體和分子可能對于理解 B 細(xì)胞介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制或保護(hù)至關(guān)重要。

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斯坦福大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)通過大規(guī)模流式細(xì)胞儀確定了人類 B 細(xì)胞表達(dá)的 98 個(gè)表面分子，確定了四種組織中的十二個(gè)B 細(xì)胞亞群。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)上，文獻(xiàn)采用了質(zhì)譜流式技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)，以及單細(xì)胞代謝譜等先進(jìn)的單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)，形成的框架和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)集也構(gòu)成了研究人類 B 細(xì)胞身份和功能的重要資源。

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