腦科學(xué)實(shí)驗(yàn)的艱難經(jīng)歷

? ? ?王慶浩?

1.?? 腦科學(xué)研究的難點(diǎn)

隨著科學(xué)的發(fā)展，人類對(duì)大到天體，小到原子已經(jīng)有了一定的了解，但對(duì)我們自己天天利用的大腦卻知之甚少。我們每天早晨一覺(jué)醒來(lái)，就要?jiǎng)幽X了：是再躺一會(huì)，還是立即穿衣起床？起床之后又要?jiǎng)幽X了：是先鍛煉一會(huì)兒，還是立即做飯？一天之內(nèi)，我們需要不斷動(dòng)腦，不斷思維，不斷做出各種各樣的決定。我們的大腦無(wú)時(shí)不在轉(zhuǎn)動(dòng)，然而我們對(duì)大腦運(yùn)轉(zhuǎn)的秘密卻一無(wú)所知。大腦如何做出決定？思維機(jī)理是什么？意識(shí)是什么？智慧何在？喜怒哀樂(lè)的機(jī)理是什么？等等諸多疑問(wèn)，至今仍然沒(méi)有答案，仍然困擾著人類。腦科學(xué)是人類科學(xué)研究需要攻克的最后堡壘。

腦科學(xué)研究的難點(diǎn)何在？ 讓我們回顧一下腦科學(xué)研究歷史可能會(huì)受到啟發(fā)。腦科學(xué)研究成功的案例不多，但依賴人類的聰明才智和堅(jiān)忍不拔的努力，還是有幾個(gè)科學(xué)家在腦科學(xué)上作出了出類拔萃的貢獻(xiàn)?；仡櫩偨Y(jié)他們的成功或許為我們以后的研究提供一些線索。

十九世紀(jì)末，俄國(guó)科學(xué)家巴甫洛夫看到狗在沒(méi)有吃到食物之前便開(kāi)始流口水，于是通過(guò)刺激與食物關(guān)聯(lián)來(lái)誘發(fā)狗唾液外分泌進(jìn)行一連串的探索性實(shí)驗(yàn)。最終成功的揭示了條件反射。二十世紀(jì)中葉，美國(guó)科學(xué)家Roger W. Sperry通過(guò)裂腦人實(shí)驗(yàn)，成功的揭示了左右大腦功能的差異，提出了大腦不對(duì)稱性的"左右腦分工理論"。

美國(guó)科學(xué)家埃里克·坎德?tīng)柕摹蹲穼び洃浀暮圹E》生動(dòng)的講述了他自己如何發(fā)明一種方法來(lái)揭示大腦記憶的機(jī)理。二十世紀(jì)六十年代，坎德?tīng)柶鸪鯖Q定研究記憶機(jī)制，但哺乳動(dòng)物的大腦太大神經(jīng)細(xì)胞太多，很難檢測(cè)記憶過(guò)程的基本結(jié)構(gòu)和電生理的變化。通過(guò)大量分析，他決定應(yīng)用海兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，海兔的神經(jīng)系統(tǒng)僅有2萬(wàn)個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞體積相當(dāng)大?？驳?tīng)枒?yīng)用海兔實(shí)驗(yàn)成功的揭示了記憶的機(jī)理。

二十世紀(jì)70年代，O’Keefe應(yīng)用精細(xì)電極在大鼠海馬中發(fā)現(xiàn)了位置神經(jīng)細(xì)胞。90年代O’Keefe的學(xué)生莫索爾夫婦優(yōu)化此技術(shù)而發(fā)現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞。

上述腦科學(xué)研究的歷史表明，腦科學(xué)重大成果的取得都是找到了一個(gè)非常合適的切入點(diǎn)。腦科學(xué)研究的難點(diǎn)是找不到合適的切入點(diǎn)，不知道從何處下手進(jìn)行研究。在其他科學(xué)方面一個(gè)新方法可以揭示許多自然秘密。而在腦科學(xué)研究之中，發(fā)明一個(gè)新方法只能揭示一個(gè)秘密，因此發(fā)明新的研究方法才是解決腦科學(xué)的關(guān)鍵。

在腦科學(xué)的研究史上，不乏失敗之例。許多頂尖科學(xué)家為破譯腦科學(xué)之謎殫精竭慮卻收效甚微。最著名的是“分子生物學(xué)之父”克里克，從1966年開(kāi)始進(jìn)行意識(shí)研究一直到2004年去世，期間38年，也沒(méi)有搞清楚意識(shí)究竟是什么。20世紀(jì)末，腦科學(xué)引起了政府的高度重視。1990年美國(guó)總統(tǒng)布什宣布：20世紀(jì)的最后十年為“腦的十年”并投入大量經(jīng)費(fèi)，然而十年過(guò)去了，卻進(jìn)展不大。1995年，日本政府啟動(dòng)“腦科學(xué)時(shí)代”計(jì)劃，政府宣布投入200億美元把“認(rèn)識(shí)腦、保護(hù)腦、創(chuàng)造腦”作為腦研究三大目標(biāo)。然而20年后，目標(biāo)依然渺茫。2009年，歐盟腦計(jì)劃的發(fā)起人瑞士神經(jīng)科學(xué)家亨利·馬克拉姆（Henry ? Markram）夸下?？冢褐灰陼r(shí)間，他就可以用計(jì)算機(jī)模擬出一個(gè)功能細(xì)節(jié)完備的人類大腦。為此，2013年，歐盟大手筆揮給他13億歐元(約合99億元人民幣)，并將這一“人類腦計(jì)劃”項(xiàng)目立為“未來(lái)新興技術(shù)旗艦項(xiàng)目”，該項(xiàng)目也成為全球最重要的腦計(jì)劃項(xiàng)目之一。然而2019年到期了，該計(jì)劃卻破產(chǎn)了，該筆經(jīng)費(fèi)卻打了水漂。

上述事實(shí)說(shuō)明僅僅投入巨額經(jīng)費(fèi)巨大人力是不夠的，也是徒勞無(wú)功！

??盡管破解大腦之謎困難重重充滿艱辛，但人類不會(huì)對(duì)此望而生畏止步不前。明知山有虎偏向虎山行。人類對(duì)大腦的好奇心一點(diǎn)沒(méi)有減弱，一批失敗了，一批又沖上去。前赴后繼，永不停息。

2.?? 美國(guó)得到的信息

我于2012年9月到美國(guó)康奈爾大學(xué)紐約醫(yī)學(xué)院做訪問(wèn)學(xué)者，得知有二個(gè)學(xué)科處于研究前沿。一個(gè)是腫瘤，一個(gè)是腦科學(xué)。我對(duì)腦科學(xué)特別感興趣，于是，閱讀了大量腦科學(xué)研究的書籍和論文。

? ?3. Sperry的啟發(fā)

一次閱讀Roger ?Sperry論文?Optic nerve regeneration with return of vision in ?anurans（Sperry, R. W. (1944). J. Neurophysiol 7, ?57-69）：切斷蝌蚪視神經(jīng)，并把眼球旋轉(zhuǎn)180°。過(guò)一段時(shí)間，蝌蚪變成小蛙，新的視神經(jīng)會(huì)重新長(zhǎng)出與大腦連接，觀察小蛙的視覺(jué)變化。這給了我一個(gè)很大的啟發(fā)，使我突然想到，在動(dòng)物卵子發(fā)育時(shí)期的大腦形成過(guò)程中，損毀部分腦細(xì)胞，等動(dòng)物發(fā)育長(zhǎng)大后，觀察其行為變化，是否可以發(fā)現(xiàn)某些有關(guān)大腦的新現(xiàn)象？

4.?? 尋找合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2013年10月回國(guó)后開(kāi)始了這個(gè)想法的實(shí)驗(yàn)。首先是尋找合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：哪種動(dòng)物的卵可以應(yīng)用？查找資料的發(fā)現(xiàn)一些水生動(dòng)物的卵是透明的，推測(cè)在顯微鏡下可以損毀其部分大腦。恰巧天津市有一個(gè)北方最大的普濟(jì)河道花鳥(niǎo)魚蟲市場(chǎng)，專門出售各種各樣的觀賞魚類。我一次購(gòu)買三五種，帶回家中養(yǎng)一養(yǎng)試一試哪種可用。先后試過(guò)斑馬魚、燕魚、羅漢魚、國(guó)斗魚、藍(lán)曼龍、六角恐龍、金蛙等30多種。2014年3月25日觀察到金蛙產(chǎn)卵，但金蛙卵內(nèi)全是黑的，什么也看不到。2014年5月6日觀察到燕魚卵透明，燕魚很難養(yǎng)，容易死亡，而且燕魚很少產(chǎn)卵。2014年8月28日觀察到斑馬魚卵是透明的，但斑馬魚卵太小，腦部很難用玻璃針切割。2014年10月15日觀察到金蛙卵在發(fā)育過(guò)程中頭部是透明的，前腦、端腦、中腦、后腦非常清晰。當(dāng)金蛙卵處于發(fā)眼期時(shí)，兩眼之間距離很寬，大腦組織呈淺黃色，清晰可見(jiàn)。金蛙卵很大，發(fā)育后變得扁長(zhǎng)了，大腦各部分可以用玻璃針切割，適合做腦細(xì)胞損毀實(shí)驗(yàn)。盡管金蛙卵不透明，但在發(fā)育過(guò)程中，大腦是透明的。又花費(fèi)了半年才明白：不是卵透明，而是大腦透明才是最合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。金蛙每次大概產(chǎn)卵300-900個(gè)，足以滿足實(shí)驗(yàn)需要。產(chǎn)卵以春秋為多，但全年均可產(chǎn)卵。后來(lái)摸索出一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，改變水溫：把水溫由13°C增高到21-23°C，或者由21-23°C降低到13°C，可以促進(jìn)產(chǎn)卵。經(jīng)過(guò)1年的實(shí)驗(yàn)，終于找到了合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物金蛙，學(xué)名非洲爪蟾。

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左圖：金蛙抱對(duì)；右圖：金蛙卵

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從左到右：發(fā)育中的金蛙卵和顯微鏡

5.蝌蚪腦細(xì)胞損毀實(shí)驗(yàn)

找到合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物卵之后，就開(kāi)始按照設(shè)想進(jìn)行受精卵大腦發(fā)育過(guò)程的損毀實(shí)驗(yàn)了。但真做起來(lái)并不是很容易的。由于剛剛發(fā)育的大腦比針尖還小，在顯微鏡下用玻璃針切割并不是很容易的。手抖一下，位置就偏離了，總是做不準(zhǔn)。但這不是很難，練習(xí)一段時(shí)間，手就不抖了，切割就比較準(zhǔn)確，此時(shí)可以做蝌蚪大腦細(xì)胞損毀實(shí)驗(yàn)了，具體做法如下：

先用瓊脂糖在小培養(yǎng)皿里制成凝膠，用后放在水中，可以反復(fù)應(yīng)用。

2015年2月18日，蝌蚪端腦損毀實(shí)驗(yàn)：將凝膠放在顯微鏡下，用小吸管將tail-bud?stage蝌蚪吸出放在凝膠上，玻璃針刺穿大腦，損毀蝌蚪的端腦，總數(shù)做了16個(gè)。19日觀察結(jié)果：12個(gè)死亡，4個(gè)存活。之后又觀察幾天，存活蝌蚪端腦與正常蝌蚪形態(tài)一樣，似乎恢復(fù)原樣，行為沒(méi)有任何變化，與實(shí)驗(yàn)設(shè)想完全相反，這是實(shí)驗(yàn)之前沒(méi)有考慮到的。

從2015年2月到5月，做了大量的蝌蚪端腦、前腦、中腦和后腦損毀實(shí)驗(yàn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)蝌蚪都會(huì)死亡，少數(shù)不死蝌蚪大腦形態(tài)與正常蝌蚪?jīng)]有明顯變化，行為也沒(méi)有異常。

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左圖：剛出卵膜的蝌蚪；中圖：玻璃針損毀大腦細(xì)胞；右圖：玻璃針

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左圖：蝌蚪大腦；右圖：熒光染色后蝌蚪大腦

6. 蝌蚪大腦異物填塞實(shí)驗(yàn)

把異物填塞進(jìn)蝌蚪大腦不同部位會(huì)發(fā)生什么？為了解答這個(gè)問(wèn)題，我在2015年6月到2016年底進(jìn)行了一些列的實(shí)驗(yàn)。微米的顆粒很好制造，用錘子砸碎各種物體如玻璃、綠豆、木屑等，或者直接選用一些微細(xì)顆粒如細(xì)沙等，放在顯微鏡下除去大顆粒，選擇微顆粒。但蝌蚪的大腦很小，是微米級(jí)的。要把微米的異物顆粒填進(jìn)微米級(jí)的大腦可不是很容易的。微米的顆粒如何用鑷子鑷??？根本沒(méi)有這么微小的鑷子。經(jīng)過(guò)反復(fù)思考，終于想到了一個(gè)方法：用玻璃針沾膠水沾取微粒。先用玻璃針刺破蝌蚪大腦，然后用帶膠水的玻璃針沾取微粒放在刺破處，再用玻璃針將微粒導(dǎo)入蝌蚪大腦。用這種方法將鐵微粒、砂微粒、木屑、紙屑、玻璃微粒，綠豆微粒等10多種異物放入蝌蚪大腦不同位置，觀察結(jié)果與蝌蚪腦細(xì)胞損毀實(shí)驗(yàn)相同，除了大部分蝌蚪死亡之外，存活蝌蚪行為沒(méi)有異常。

7. 蝌蚪大腦切割實(shí)驗(yàn)

做了很多蝌蚪腦細(xì)胞損毀實(shí)驗(yàn)和蝌蚪大腦異物填塞實(shí)驗(yàn)都沒(méi)有取得預(yù)料的結(jié)果，或許切除蝌蚪的一部分大腦可以產(chǎn)生預(yù)料不到的結(jié)果，于是在2017年到2019年進(jìn)行了蝌蚪大腦切割實(shí)驗(yàn)。

先把蝌蚪大腦劃區(qū)，切除前部分1/4，再切除中間部分1/4，再切除后部分1/4，結(jié)果除了少數(shù)死亡外，大部分大腦形態(tài)沒(méi)有變化，行為也沒(méi)有異常。接著做了切除1/3,1/2，仍然沒(méi)有異常。再做切除前腦、中腦和后腦實(shí)驗(yàn)，行為仍然沒(méi)有明顯異常。最后把整個(gè)大腦全切除了，蝌蚪仍然可以發(fā)育，仍然存活，但卻出現(xiàn)明顯異常，蝌蚪發(fā)育不完善，可以發(fā)育出脊髓，但沒(méi)有頭，沒(méi)有內(nèi)臟器官。但令人驚奇的是，這些無(wú)頭蝌蚪仍然對(duì)刺激有反應(yīng)，仍然可以游動(dòng)，只能向前游動(dòng)，不能后退，幾天后當(dāng)卵黃囊的營(yíng)養(yǎng)耗盡之后就會(huì)死亡。蝌蚪?jīng)]有頭卻對(duì)刺激有反應(yīng)，卻可以游動(dòng)，這引起了我極大的好奇心，于是轉(zhuǎn)向了斷頭動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究。

8. 斷頭蟋蟀實(shí)驗(yàn)

2020年我招了二個(gè)研究生，除了傳統(tǒng)研究之外，安排她們做了斷頭蟋蟀實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果于2023年7月3日公布在著名生物預(yù)印本bioRxiv。在該論文中，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)頭蟋蟀展現(xiàn)智力，揭示了腦外智力新發(fā)現(xiàn)。這為腦科學(xué)研究增添了一種新方法。