蛋白質(zhì)從頭測(cè)序是一種不依賴于任何已知的序列或者蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)信息，直接對(duì)氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定的全新技術(shù)，是醫(yī)療診斷和治療領(lǐng)域必備的序列發(fā)現(xiàn)技術(shù)。針對(duì)大家對(duì)蛋白從頭測(cè)序送樣的樣品要求和細(xì)節(jié)的一些疑問(wèn)和困惑，我們匯總整理了以下常見(jiàn)問(wèn)題供大家參考。

Q1：蛋白從頭測(cè)序與Edman 降解法測(cè)序列有什么區(qū)別？

A：蛋白從頭測(cè)序應(yīng)用de novo從頭測(cè)序算法，直接通過(guò)質(zhì)譜譜圖中的離子信息來(lái)推導(dǎo)肽段的序列。Edman 降解法一般適合15-20個(gè)氨基酸組成的肽段，且對(duì)于樣品純度要求也比較高，至少97%純度以上；同時(shí)還要進(jìn)行蛋白酶解、肽段分離純化和肽段逐一上機(jī)測(cè)試，另外，對(duì)于一個(gè)單抗進(jìn)行Edman降解測(cè)序的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本也比較高。
與傳統(tǒng)的Edman降解法相比。基于質(zhì)譜的de novo從頭測(cè)序更加高效率、高通量和低成本。在已知蛋白氨基酸序列的情況下，de novo從頭測(cè)序還可以發(fā)現(xiàn)新的蛋白變體，這些變體可能來(lái)自于未知的突變，剪切拼接和各種翻譯后修飾，為單抗序列提供更全面的信息。

Q2：蛋白從頭測(cè)序的樣品類型有哪些？

A：蛋白從頭測(cè)序和蛋白的大小長(zhǎng)度無(wú)關(guān)，單抗、Fab/Fc、雙抗、多抗、重組蛋白、多肽、熒光標(biāo)記抗體、交聯(lián)抗體等均可以進(jìn)行從頭測(cè)序。

Q3：熒光標(biāo)記或者交聯(lián)抗體能夠做從頭測(cè)序嗎？

A：蛋白交聯(lián)在Beads上或者是熒光標(biāo)記的蛋白如流式抗體FITC、Cyc5、PE等標(biāo)記的抗體也是能夠進(jìn)行從頭測(cè)序的。

Q4：蛋白從頭測(cè)序的送樣要求是什么？

A：蛋白從頭測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的送樣量是100ug，純度是90%以上，有最低20ug測(cè)序成功的經(jīng)驗(yàn)。蛋白純度對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響較大，雜的抗體蛋白、同源蛋白及BSA等會(huì)對(duì)樣品測(cè)序產(chǎn)生干擾，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Q5：樣品buffer成分對(duì)測(cè)序結(jié)果有影響嗎？

A：蛋白溶解緩沖液標(biāo)準(zhǔn)的送樣建議是使用PBS或Tris緩沖液體系，此外如果有甘油、BSA、去垢劑、鹽等成分，我們會(huì)有相應(yīng)的方法做一些純化處理，所以是不影響測(cè)序結(jié)果的。

Q6：樣品糖基化和翻譯后修飾會(huì)影響測(cè)序嗎？

A：數(shù)據(jù)分析時(shí)會(huì)將可能的翻譯后修飾和糖基化修飾考慮在內(nèi)，不影響樣品本身測(cè)序結(jié)果。

Q7：蛋白從頭測(cè)序使用的儀器？

A：目前，我們使用的是賽默飛的三合一超高分辨質(zhì)譜儀，型號(hào)為Orbitrap Fusion或者Orbitrap Eclipse。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，百蓁技術(shù)平臺(tái)將會(huì)陸續(xù)引進(jìn)更多高端新儀器，為廣大客戶帶來(lái)更優(yōu)質(zhì)的服務(wù)。

Q8：蛋白從頭測(cè)序的報(bào)告內(nèi)容？

A：①完整的蛋白氨基酸序列，抗體包括重鏈和輕鏈序列，恒定區(qū)和可變區(qū)。
②完整分子量驗(yàn)證信息，將實(shí)際測(cè)得的分子量與理論序列分子量進(jìn)行比對(duì)來(lái)驗(yàn)證序列的準(zhǔn)確性。
③完整序列的肽段覆蓋圖，每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸有超過(guò)十種不同的肽段支持。
④抗體可變區(qū)肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖支撐。
⑤I/L鑒定的可信度分析。

Q9：蛋白從頭測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確度如何？

A：①測(cè)序結(jié)果保證全序列覆蓋和100%序列準(zhǔn)確，每個(gè)位點(diǎn)的氨基酸有超過(guò)十種不同的肽段支持，每個(gè)氨基酸在質(zhì)譜圖里有強(qiáng)的碎片離子峰證據(jù)。測(cè)序結(jié)果結(jié)合軟件算法和人工檢驗(yàn)，雙重保證序列準(zhǔn)確性。
②百蓁生物創(chuàng)始人李明院士是蛋白從頭測(cè)序算法的主要發(fā)明人，PEAKS系列軟件更是行業(yè)從頭測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)，百蓁生物母公司BSI在從頭測(cè)序領(lǐng)域有20多年的經(jīng)驗(yàn)積累，一直以來(lái)為國(guó)內(nèi)外眾多制藥企業(yè)提供專業(yè)的測(cè)序服務(wù)，測(cè)序方法經(jīng)得住時(shí)間的考驗(yàn)。

Q10：蛋白從頭測(cè)序的周期是多久？

A：符合送樣要求，從開(kāi)始檢測(cè)到報(bào)告發(fā)送標(biāo)準(zhǔn)的服務(wù)周期是一周。

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