繼證明NEK7是小檗堿（berberine，BBR）治療炎癥相關(guān)疾病的主要直接靶點(diǎn)后，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所宋丹青導(dǎo)師和汪燕翔導(dǎo)師團(tuán)隊(duì)又發(fā)現(xiàn)并證明了EIF2AK2也可作為BBR抗炎作用的直接關(guān)鍵靶點(diǎn)，相關(guān)研究成果發(fā)表在APSB（Discovery and identification of EIF2AK2 as a direct key target of berberine for anti-inflammatory effects?；IF 14.903；2022年12月）上，和小編一起共享這一成果吧！

01?研究背景

小檗堿（berberine，BBR）可從黃連、黃柏、血紅小檗等植物的根莖中通過分離提取出來天然生物堿，在過去的20年中，它被作為中國天然抗瘧藥物廣泛應(yīng)用。雖有較多包括RXRα、NEK7、MKK7等在內(nèi)的作用靶點(diǎn)已被鑒定和證明，但是BBR復(fù)雜而巧妙的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制尚未完全闡明。文章選用活性蛋白組分析技術(shù)（ABPP），使用BBR親和探針尋找對(duì)抗炎癥的關(guān)鍵直接靶點(diǎn)；通過體外結(jié)合試驗(yàn)和正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，表明EIF2AK3是BBR抗炎作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

02?樣本策略

LPS和Nigericin誘導(dǎo)PMA-THP-1細(xì)胞；EIF2AK2 siRNA誘導(dǎo)HEK-293細(xì)胞、HMCC3細(xì)胞、Hepg2細(xì)胞；EIF2AK2基因敲低小鼠

03?技術(shù)策略

LC-MS/MS鑒定（青蓮百奧提供）

04?結(jié)果速遞

1.THP-1細(xì)胞中BBR靶點(diǎn)的熒光標(biāo)記

文章用LPS和Nigericin誘導(dǎo)PMA-THP-1細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型，用Elisa分析培養(yǎng)基上清中分泌的炎癥因子，結(jié)果表明probes-7a和probes-11b表現(xiàn)出較好的抑制IL-1β的作用；用ABPP法測(cè)定和識(shí)別兩探針的靶向作用，結(jié)合SDS-PAGE評(píng)估并篩選合成的BBR光親和熒光探針，結(jié)果表明probes-11b在一定的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出更顯著的熒光強(qiáng)度。

2.BBR靶標(biāo)蛋白分析

文章用probes-11b與PMA-THP-1細(xì)胞進(jìn)行孵育，加入或不加入BBR（100μmol/L）預(yù)處理；通過LC-MS/MS分析鑒定被標(biāo)記的蛋白?；虮倔w（GO）富集表明，44種蛋白密切參與各種炎癥信號(hào)通路，其中13種是通過蛋白相互作用分析的炎癥相關(guān)蛋白。通過分析這些蛋白的綜合功能和參與途徑，包括EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3、DDX3X、VASP和VPS4B在內(nèi)的六種蛋白可以調(diào)節(jié)兩種或多種炎癥途徑，并有可能在BBR的抗炎效力中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3.BBR與其潛在靶標(biāo)之間的親和力研究

在HEK-293細(xì)胞中進(jìn)行CETSA實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證BBR與四種靶蛋白之間的相互作用。在35至75℃的溫度范圍內(nèi)，添加BBR（10μmol/L），EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B的熱穩(wěn)定性得到不同程度的增強(qiáng)（圖3A），表明BBR與這四種蛋白質(zhì)之間可能存在直接相互作用。隨后，使用重組蛋白進(jìn)行SPR分析以進(jìn)一步確認(rèn)，具有EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B的BBR的Kd值分別為7.12、13.4、23.7和16.8μmol/L（圖3B–E）。此外，使用Discovery Studio 4.5軟件進(jìn)行了BBR與四種蛋白質(zhì)之間的分子對(duì)接，對(duì)接得分分別為100.2、88.8、86.7和91.6，與親和力值基本一致（圖3F）。這些結(jié)果再次驗(yàn)證了BBR與這四種靶蛋白之間的特異性相互作用，其中BBR與EIF2AK2具有最強(qiáng)的親和力。

4.體內(nèi)外功能驗(yàn)證EIF2AK2是BBR作用靶標(biāo)

為了進(jìn)一步了解EIF2AK2的功能作用，選用PMA-THP-1細(xì)胞中IL-1β的釋放來驗(yàn)證NLRP3炎癥小體的功能。BBR抑制NLRP3的表達(dá)從而阻斷下游IL-1β的釋放，而EIF2AK2受到其抑制劑C16的藥理學(xué)抑制，未觀察到NLRP3表達(dá)和IL-1β釋放的減少（圖4D和E），這推斷BBR可能通過作用于EIF2AK1來抑制NLRP2的表達(dá)和IL-1β的釋放。

由于EIF2AK2在腦組織中相對(duì)高表達(dá)，文章驗(yàn)證了EIF2AK2與人源性小膠質(zhì)細(xì)胞（HMC3）中炎癥通路的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)BBR可以下調(diào)LPS誘導(dǎo)的p-NF-κB p65和pJNK（圖4F和G），而下調(diào)EIF2AK2后，BBR對(duì)p-NF-κB p65和p-JNK的抑制作用部分或完全消失。這說明，BBR可以通過靶向EIF2AK2影響大腦炎癥反應(yīng)，并提供了BBR如何在大腦中產(chǎn)生抗炎相關(guān)疾病的可能機(jī)制，如阿爾茨海默病中的膠質(zhì)細(xì)胞增生和認(rèn)知障礙。

另外，BBR可以抑制棕櫚酸（PA）誘導(dǎo)的p-JNK水平，并上調(diào)HepG2細(xì)胞中SIRT1蛋白的表達(dá)。結(jié)果進(jìn)一步表明，BBR可能通過與關(guān)鍵蛋白EIF2AK2結(jié)合來調(diào)節(jié)炎癥誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂(圖4H)。

構(gòu)建了EIF2AK1敲除小鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BBR可能通過靶向EIF2AK2下調(diào)IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α分泌（圖5B–F）。肝臟的HE染色結(jié)果也同樣發(fā)現(xiàn)，在EIF2AK2基因敲除小鼠中，BBR減輕了肝臟組織的炎癥浸潤，而在其他組織中未發(fā)現(xiàn)明顯損傷。

05?總結(jié)

利用化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，我們首次將EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B鑒定為小檗堿（BBR）協(xié)同抗炎作用的直接靶點(diǎn)。其中，BBR通過兩個(gè)離子鍵與EIF2AK2具有最強(qiáng)的親和力；此外，BBR可以微妙地抑制EIF2AK4的二聚化，以選擇性地調(diào)節(jié)其下游途徑，包括JNK、NF-κB、AKT和NLRP3，具有良好的安全特性的優(yōu)點(diǎn)。該結(jié)果突出了BBR在抗炎作用中的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，其中EIF2AK2是關(guān)鍵靶點(diǎn)，抑制EIF2AK1二聚化有可能成為對(duì)抗炎癥相關(guān)疾病的治療跨界。