標(biāo)題：A multifunctional true caffeoyl coenzyme A O-methyltransferase enzyme participates in the biosynthesis of polymethoxylated flavones in citrus.

期刊：Plant Physiology?Oncogene（IF =8.756）

時(shí)間：2023.03

背景

柑橘類植物是一類重要的經(jīng)濟(jì)作物，富含多種生物活性化合物，其中多甲氧基黃酮是其特有的類黃酮成分之一。多甲氧基黃酮(PMFs)在植物中具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種生物活性。大量的研究報(bào)道也表明PMFs在治療糖尿病、心血管疾病、結(jié)腸癌、肥胖癥、癡呆癥等方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)人類健康具有重要意義。然而，關(guān)于PMFs在柑橘類植物中的合成機(jī)制及其參與的酶仍存在許多不明確的地方。

研究思路

柑橘果皮特異性地積累豐富的PMFs，甲基化修飾是PMFs生物合成的關(guān)鍵步驟；然而，報(bào)道的柑橘O-甲基轉(zhuǎn)移酶（OMT）的功能不足以闡明PMFs的完整甲基化過程。作者以橙子品種“冰糖橙”為試材，研究了不同發(fā)育時(shí)期果皮中PMFs的積累規(guī)律。為揭示多PMFs的生物合成途徑和相關(guān)酶的功能，研究選擇了一個(gè)名為CsCCoAOMT1的酶進(jìn)行深入研究。通過對(duì)CsCCoAOMT1的功能研究，可以更好地理解多甲氧基黃酮的合成機(jī)制以及柑橘類植物中相關(guān)代謝途徑的調(diào)控機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

1、橙子PMFs積累規(guī)律研究

PMFs是一類重要的類黃酮，其骨架中的所有羥基都會(huì)被甲基化，并且在不同柑橘品種和組織中的含量顯示出實(shí)質(zhì)性差異。在對(duì)62個(gè)柑橘品種的黃酮類化合物代謝分析中，發(fā)現(xiàn)柑橘的PMFs含量最高，其次是橙子，而檸檬和葡萄柚的PMFs含量則相對(duì)較低。PMFs在橙子果實(shí)的外果皮中含量豐富，在其他組織中未檢測(cè)到。為進(jìn)一步闡明冰糖橙果實(shí)中PMFs的積累規(guī)律，作者對(duì)不同發(fā)育時(shí)期（S1 ~ S9）果皮中PMFs的含量進(jìn)行了分析，共檢測(cè)到6種PMFs，即異橙黃酮（Isosinensetin）,?甲基化黃酮（Sinensetin），川陳皮素（Nobiletin），木犀草素四甲醚(5,7,3',4'-Tetramethoxyflavone )，甲氧基黃酮（Heptamethoxyflavone），桔皮素（Tangeretin）。其中，甲基化黃酮（Sinensetin）是“冰糖橙”中積累的主要PMF，平均值占PMFs總量的57%，其次是川陳皮素（Nobiletin），占PMFs總量的24%。除Heptamethoxyflavone外，所有PMFs在S1 ~ S9期間均呈現(xiàn)出一致的變化趨勢(shì)，在S2達(dá)到最高值，S2-S4下降;在S5階段出現(xiàn)一個(gè)小峰值，然后下降到S6階段，PMFs含量在S6-S9階段趨于穩(wěn)定。表明PMFs的積累可能是在果實(shí)發(fā)育早期完成的，S6及以后各時(shí)期PMFs含量的急劇下降可能與S6時(shí)期果實(shí)的快速膨大有關(guān)。

2、CsCCoAOMT 1是一種多功能的O-甲基轉(zhuǎn)移酶

在柑橘類黃酮OMTs的鑒定方面包括功能預(yù)測(cè)、基因克隆和功能鑒定，許多研究都集中在COMT亞家族，作者最終鑒定出3個(gè)參與類黃酮體外甲基化的COMTs（分別對(duì)應(yīng)于CsOMTs中的Cs2g05400、Cs5g16290和orange1.1t04194）。在分析CCoAOMT亞家族7個(gè)成員在“冰糖橙”果實(shí)外果皮不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平后發(fā)現(xiàn)兩個(gè)CCoAOMT基因（Cs1g22450和Cs8g05410）在早期發(fā)育階段表現(xiàn)出明顯的高表達(dá)，這與PMFs在該時(shí)期的快速積累相一致。因此，這兩個(gè)基因被認(rèn)為是參與PMFs生物合成的候選基因。其中一個(gè)候選基因（Cs 1g 22450）已被證明參與柑橘中的PMF生物合成（Liu et al. 2020b）。因此選擇另一個(gè)候選基因（Cs 8 g 05410，命名為CsCCoAOMT 1）進(jìn)行后續(xù)深入研究。為了進(jìn)一步闡明CsCCoAOMT1的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，作者選取了34個(gè)不同植物種類的CCoAOMT，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。鑒定出一個(gè)CCoAOMT亞群成員（Cs8g05410）名為CsCCoAOMT1。從“冰糖橙”外果皮cDNA文庫中克隆了CsCCoAOMT 1基因的全長(zhǎng)。CsCCoAOMT 1編碼的蛋白質(zhì)通過His標(biāo)簽進(jìn)行重組蛋白表達(dá)。通過質(zhì)譜法檢測(cè)CsCCoAOMT1蛋白的表達(dá)水平（青蓮百奧提供技術(shù)服務(wù)）。通過酶活性分析和代謝物檢測(cè)來揭示CCoAOMT的催化特性和參與的代謝途徑。他們發(fā)現(xiàn)CCoAOMT不僅可以催化咖啡酰輔酶A的O-甲基化反應(yīng)，還具備O-甲基轉(zhuǎn)移其他底物的能力，表明該酶具有多功能性。

3、CsCCoAOMT1促進(jìn)柑橘多個(gè)PMFs的積累

作者在柑橘中鑒定了CCoAOMT，并證實(shí)了其在體外對(duì)PMFs的潛在前體的偏好。CsCCoAOMT1與Ciclev10029158m序列同源性為98%，甲基化位點(diǎn)較CrOMT1更寬，且在發(fā)育過程中在果皮中PMFs積累前表現(xiàn)出較高水平，說明CsCCoAOMT1參與了黃酮類化合物甲基化。CsCCoAOMT1在果實(shí)發(fā)育早期（S1）表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)錄水平，這表明該基因可能是在隨后20 d內(nèi)PMFs持續(xù)增加的原因。CsCCoAOMTl在S6至S7處的高表達(dá)可能與果皮發(fā)育后期增強(qiáng)的木質(zhì)素積累相關(guān)，其對(duì)應(yīng)于CsCCoAOMT 1在體外對(duì)木質(zhì)素前體咖啡酰輔酶A的催化活性。CsCCoAOMT 1在“冰糖橙”果皮中瞬時(shí)過表達(dá)后，6種PMFs的含量均顯著上調(diào)，其中川陳皮素（Nobiletin）和甲氧基黃酮（Heptamethoxyflavone）的含量變化極顯著（P < 0.01）。這兩個(gè)PMFs都有至少4個(gè)O-甲基化位點(diǎn)，與CsCCoAOMT 1在體外的甲基化位點(diǎn)完全一致。同時(shí)，CsCCoAOMT 1基因在橙子幼苗中被沉默，而5種主要的PMFs（sinensetin、nobiletin、5，6，7，4 ′-tetramethoxyflavone、tangeretin和5-HPMF）在陽性植株中也表現(xiàn)出極顯著的下調(diào)，而橙皮苷含量沒有觀察到顯著的變化。這些結(jié)果揭示CsCCoAOMT 1表達(dá)與柑橘PMFs積累之間的正相關(guān)性，并支持CsCCoAOMT 1可以促進(jìn)柑橘中多種PMFs的積累。

總結(jié)

作者描述了柑橘果皮中PMFs含量的動(dòng)態(tài)變化，并捕捉到了PMFs生物合成的關(guān)鍵時(shí)期。對(duì)柑橘中一種CCoAOMT酶CsCCoAOMT1進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)它在體外表現(xiàn)出對(duì)槲皮素和黃酮類底物的強(qiáng)烈偏好性，在鄰位羥基環(huán)境下甲基化6、7、8和3′位羥基，是PMFs生物合成的重要位點(diǎn)。此外，CsCCoAOMT1作為一個(gè)多功能酶，顯示低催化活性的咖啡酰輔酶A和七葉素。體內(nèi)瞬時(shí)過表達(dá)和VIGS實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CsCCoAOMT1在促進(jìn)柑橘中多種PMFs的生物合成中具有重要作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)于改善柑橘果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)以及利用酶工程合成天然生物活性物質(zhì)具有重要意義。