2022年7月，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院范先群課題組在?Journal of Experimental & Clinical Cancer Research?發(fā)表了題名為“Proteotranscriptomics of ocular adnexal B-cell lymphoma reveals an oncogenic role of alternative splicing and identifies a diagnostic marker”的研究論文，該研究利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)以及其它技術(shù)手段提供了一個綜合的基因表達譜，并證明了高全局蛋白質(zhì)-mRNA一致性是眼附屬器 B 細胞淋巴瘤（OABL）的預(yù)后相關(guān)分子特征，此外，作者還描繪了 OABL 的選擇性剪接事件景觀，并揭示了 ADAR 的致癌作用。該研究中的轉(zhuǎn)錄組測序和 TMT 蛋白組服務(wù)由博奧晶典提供。

【發(fā)表期刊】Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

【發(fā)布時間】2022年7月

【影響因子】12.658

01

研究路線

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研究背景

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。根據(jù)瘤細胞分為非霍奇金淋巴瘤（NHLs）和霍奇金淋巴瘤（HLs）兩類。眼附屬器淋巴瘤 (OAL) 是一種罕見的惡性淋巴增生，占 NHLs 的 1-2%。OALs 常出現(xiàn)在結(jié)膜、眼瞼和眼眶，還有淚腺等部位。大多數(shù) OALs 是 B 細胞淋巴瘤。結(jié)外邊緣區(qū) B 細胞淋巴瘤 (EMZL) 是 OABL 最常見的亞型 (55–69%)，其次是彌漫性大 B 細胞淋巴瘤 (DLBCL) (10–15%)。近年來，雖然 NHLs 的研究已經(jīng)實現(xiàn)了突破性進展，但對 OABL 的研究很少。

03

研究結(jié)果

1. OABL 的綜合蛋白轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜

作者按照研究路線中的流程來進行 OABL 的研究。通過對轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中的高可變基因 (HVGs) 和樣本進行層次聚類，發(fā)現(xiàn)大多數(shù) OABLs 和對照分為兩組。在去除低豐度轉(zhuǎn)錄物/蛋白質(zhì)后，將轉(zhuǎn)錄物和蛋白質(zhì)映射到 Ensembl ID，并在這些樣本中檢測到 3639 個蛋白質(zhì)-mRNA 對。對于這些蛋白質(zhì)-mRNA 對，計算了 OABLs 和對照之間的差異表達基因（DEGs）（圖 1B）。結(jié)果表明，與對照相比，OABLs 蛋白質(zhì)組中有 787 個基因上調(diào)，542 個基因下調(diào)；OABLs 轉(zhuǎn)錄組中 806 個基因上調(diào)，445 個基因下調(diào)。通過組學(xué)數(shù)據(jù)匹配結(jié)果，發(fā)現(xiàn) 451 個基因一致上調(diào)（CO-UP），386 個基因一致下調(diào)（CO-DOWN )。CO-UP DEGs 主要富集于免疫相關(guān)、GTPase 信號、磷酸鹽代謝過程的負調(diào)控和 DNA 重組等 GO 條目。CO-DOWN DEGs 主要富集于正常組織發(fā)育、一元羧酸、精氨酸和脯氨酸代謝等 GO 條目（圖1C）。

為了避免研究的潛在系統(tǒng)偏差，作者進一步進行 GSEA 分析以識別 OABLs 中重疊的失調(diào)基因集。通過蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)鑒定出總共 1023 個基因集。其中，763 個基因集在至少一種類型的組學(xué)中顯著失調(diào)，725 個基因集一致失調(diào)（圖1D）。根據(jù)每個組學(xué)中 NES 等級的總和排列，CO-UP 基因集主要富集于 mRNA 加工和剪接、DNA 損傷和修復(fù)以及蛋白質(zhì)蘇木化等條目。CO-DOWN 基因集主要富集于正常組織發(fā)育，以及有氧葡萄糖代謝等條目（圖1E）。

圖1 OABL 的蛋白轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
2、全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性是 OABL 的遠處復(fù)發(fā)相關(guān)特征接下來，作者檢查了蛋白質(zhì)和 mRNA 豐度之間的關(guān)系及其與疾病特征的關(guān)聯(lián)。全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性計算為每位患者所有配對蛋白質(zhì)和 mRNA 豐度的 Spearman 相關(guān)結(jié)果（圖2A）?？紤]到 OABLs 和對照之間不同的轉(zhuǎn)錄本/蛋白質(zhì)豐度分布，分別分析了這兩組中的蛋白質(zhì)-mRNA 對。在 OABLs中鑒定出 3818 對蛋白質(zhì)-mRNA 對，在對照中鑒定出 3728 對。OABLs 的一致性顯著高于對照組（圖2B-C）?？紤]到炎癥和淋巴瘤之間的關(guān)聯(lián)，比較了亞組樣本的全局一致性。結(jié)果表明，OABLs 表現(xiàn)出比其他組更高的一致性。這些數(shù)據(jù)表明，蛋白質(zhì)和 mRNA 豐度之間的相關(guān)性增加是 OABLs 的疾病相關(guān)特征。作者接下來分析了蛋白質(zhì)-mRNA 一致性是否與疾病侵襲性有關(guān)。比較了亞型、Ann Arbor 分期和預(yù)后風(fēng)險因素之間的一致性（圖2D）。結(jié)果顯示，無 EMZL 亞型的一致性顯著高于 EMZL 亞型，高一致性與較高的 LDH 和 IPI 兩個 NHLs 預(yù)后危險因素顯著相關(guān)，另外，高一致性還與較高的 Ann Arbor 階段相關(guān)。接下來，測試了蛋白質(zhì)-mRNA 一致性與 OABL 預(yù)后之間的相關(guān)性。作者使用一致性的中值將 OABL 患者分為兩組，生存分析顯示，OABL 的全局一致性增加與 DRFS 降低顯著相關(guān)。然后，比較了有和沒有復(fù)發(fā)事件的患者之間的全局一致性（圖2F）。高一致性與遠處復(fù)發(fā)事件顯著相關(guān)，但與局部復(fù)發(fā)事件無關(guān)。隨后，作者繼續(xù)研究了異常上調(diào)的全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性的潛在調(diào)節(jié)劑和生物學(xué)意義。因為全局一致性是一個內(nèi)在的連續(xù)變量，作者檢查了 GSVA 結(jié)果與一致性之間的相關(guān)性（圖 2H）。在前 20 個正相關(guān)基因集中，有 8 個基因集是 TP53 相關(guān)基因集，其余大部分是免疫相關(guān)基因集。這些發(fā)現(xiàn)表明，增加的整體蛋白-mRNA 一致性是 OABLs 的一個新分子特征，與疾病侵襲性和更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)，OABL 中這種異常上調(diào)的一致性與 TP53 通路呈正相關(guān)。

圖2 全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性識別為 OABL 相關(guān)特征

3、趨勢分析將選擇性剪接確定為 OABL 的炎癥獨立特征在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，作者通過層次聚類、主成分分析和全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性觀察到炎癥和 OABL 樣本之間分子特征的相似性（圖2C，圖3A-B）。先前研究表明，NFκB 信號通路在炎癥和 NHLs 中激活，作者在跨亞組的 NFκB 信號通路中進行了層次聚類（圖3C），NFκB 相關(guān)基因的豐度逐漸增加，從正常到炎癥再到 OABLs，這與之前的報道一致。隨后，作者通過對正常、炎癥和 OABL 組的監(jiān)督和非監(jiān)督聚類基因在蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中構(gòu)建了一個炎癥-OABL 特征。作者對每兩組之間的蛋白質(zhì)豐度進行了 t 檢驗，并假設(shè)了九種失調(diào)的基因模式（圖 3F），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)由上調(diào)模式構(gòu)成。結(jié)合 k-means 聚類和 t 檢驗基因模式的結(jié)果，作者確定了五個基因簇：炎癥模擬上調(diào)基因（MIMIC-UP）、模糊上調(diào)基因（VAGUE-UP）、OABL 特異性上調(diào)基因（SPECIFIC-UP） ，炎癥模擬下調(diào)基因（MIMIC-DOWN）和 OABL 特異性下調(diào)基因（SPECIFIC-DOWN）（圖3G）。因為上調(diào)的基因構(gòu)成了大多數(shù)聚集蛋白，作者專注于 MIMIC-UP 和 SPECIFIC-UP，它們代表了極其不同的失調(diào)模式。MIMIC-UP 主要富含免疫相關(guān)基因集，而 SPECIFIC-UP 主要富含與 mRNA 代謝和剪接、DNA 損傷和代謝以及染色質(zhì)重塑相關(guān)的基因集（圖 3H）。這些結(jié)果清楚地表明，炎癥組和 OABLs 組之間的相似性不僅存在于 NFκB 途徑中，還存在于更大的免疫環(huán)境中。另外，作者確定了 OABL 中特異性失調(diào)的基因集，包括 mRNA 剪接和與惡性腫瘤發(fā)展相關(guān)的途徑（DNA 損傷、染色質(zhì)重塑）。

圖3 炎癥-ABL 蛋白特征的建立

4、選擇性剪接及其調(diào)節(jié)器可能影響 OABL 的發(fā)展和進展

選擇性剪接在 OABL 中起著重要作用。研究結(jié)果揭示了 OABLs 中炎癥獨立模式中的可變剪接失調(diào)（圖1E，3H）。據(jù)報道，選擇性剪接與惡性腫瘤的發(fā)展和進展有關(guān)。因此，作者假設(shè)可變剪接可能在 OABL 中發(fā)揮致癌作用。

接下來，作者構(gòu)建了一個工作流程來 1）評估原始 RNA 測序數(shù)據(jù)并與對照相比識別 OABL 的異常選擇性剪接事件（AASE）；2) 聯(lián)合臨床數(shù)據(jù)以識別與預(yù)后相關(guān)的 AASE；3）結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)研究潛在的剪接調(diào)節(jié)因子和 AASE 的生物學(xué)功能（圖4A）。分析了五種類型的選擇性剪接事件（ASE）：替代 3' 剪接位點 (A3)、替代 5' 剪接位點 (A5)、互斥外顯子 (MX)、保留內(nèi)含子 (RI) 和跳躍外顯子 (SE)，共鑒定出 1806 個 AASEs。這些 AASEs 總共影響了 916 個基因，其中大多數(shù)受 SE 影響（圖4C）。在 916 個 AASEs 相關(guān)基因中，651 個基因僅受一種 ASE 的調(diào)節(jié)，而其余基因則受多種 ASEs 的影響（圖4B）。

隨后，研究了 AASE 的生物學(xué)意義。AASE 相關(guān)基因富集在細胞骨架、Rho GTPase 和細胞器相關(guān)條目（圖4D）。然后，通過將 AASE Inclevel 與蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的 GSVA 結(jié)果相關(guān)聯(lián)來分析潛在的牽連生物學(xué)功能（圖4E）。在列出的前 20個 基因集中，有 8 個與 DNA 損傷和細胞周期有關(guān)。這些數(shù)據(jù)共同表明 AASE 廣泛存在于 OABL 中并與預(yù)后相關(guān)，表現(xiàn)出選擇性剪接的基因與 OABL 中失調(diào)的基因集有關(guān)。AASE 與關(guān)鍵的生物學(xué)功能相關(guān)，如 DNA 損傷和細胞周期，這可能意味著它們充當(dāng)這些過程的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。

圖4 OABL 異常選擇性剪接事件
5、ADAR 是 OABL 中選擇性剪接的核心調(diào)節(jié)因子，影響關(guān)鍵生物學(xué)功能ADAR 是作用于 RNA 酶家族的腺苷脫氨酶的成員，可催化雙鏈 RNA 中的腺苷編輯為肌苷。在相關(guān)性分析中，作者發(fā)現(xiàn) ADAR 是與 AASE 和進展相關(guān) AASE 相聯(lián)系的高頻剪接因子（SF）（圖 4F，H）。作者接下來研究了與 ADAR 相關(guān)的潛在生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn) ADAR 的蛋白質(zhì)豐度與影響 145 個基因的 280 個 AASEs 密切相關(guān)。這些基因大多富含 Rho GTPase 相關(guān)基因集（圖5A），這是腫瘤起始和進展中細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要基因集和關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)。為了進一步檢查 ADAR 的作用，作者在 11 組 ADAR 敲低 (KD)、敲除或過表達癌細胞系中鑒定了 AASE。共有 1472 個基因反復(fù)受到 ADAR 調(diào)節(jié)的 AASE 的影響。這些基因也富含 Rho GTPase 相關(guān)基因集（圖5B）。因為受影響的基因富含凋亡和增殖相關(guān)基因集（圖5A，B），作者研究了 ADAR 和 MKI67 之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ADAR 蛋白豐度與 MKI67 呈正相關(guān)（圖5C）。為了驗證假設(shè)的調(diào)節(jié)作用，作者建立了 ADAR KD NHL 細胞系。與對照細胞相比，ADAR KD 細胞系表現(xiàn)出顯著降低的細胞增殖（圖5E）。進一步發(fā)現(xiàn) ADAR KD 使 NHL 細胞系對 Rho GTPase 抑制劑敏感。Rho GTPase 抑制劑在處理 72 小時后的 IC50 在 ADAR KD 細胞系中低于對照（圖5F）。這些結(jié)果表明，ADAR 是 OABL 中可變剪接的核心調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)細胞增殖和對 Rho GTPase 抑制劑的敏感性。

圖5 ADAR 調(diào)節(jié) OABL 中的關(guān)鍵生物學(xué)功能
6、蛋白質(zhì)組學(xué)分析將 DNAJC9 鑒定為 EMZL 的診斷標(biāo)志物OABL 的病理診斷仍然很困難。因此，作者檢查了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)以研究 OABL 的潛在診斷標(biāo)志物。生物標(biāo)志物檢測的工作流程如圖6A 所示。為了篩選生物標(biāo)志物，首先通過單變量邏輯回歸確定了 98 種差異表達的蛋白質(zhì)和 98 種重要的蛋白質(zhì)。接下來，將 85 個重疊的蛋白質(zhì)納入 lasso 懲罰回歸模型，通過 200 次交叉驗證迭代分析得到 4 種蛋白質(zhì)（DNAJC9、TFEB、SUMO3 和 MBD1）。然后對這些蛋白質(zhì)進行逐步邏輯回歸，DNAJC9 是唯一確定的蛋白質(zhì)。為了驗證結(jié)果，分析了各組 DNAJC9 的蛋白質(zhì)豐度（圖6B）。與對照組、IOI 和 RLH 組相比，OABLs 中的 DNAJC9 豐度顯著更高。與對照相比，OABL 所有亞型的 DNAJC9 豐度也顯著升高。與傳統(tǒng)的診斷標(biāo)志物 CD20 和 PAX5 相比，DNAJC9 表現(xiàn)出相對較高的 AUC 值（圖 6C）。接下來，作者研究了 DNAJC9 在患者 FFPE 樣本中的診斷性能。選擇 EMZL 和 DLBCL（OABL 的兩個主要亞型）作為實驗組，炎癥樣本作為對照。亞細胞定位分析表明，DNAJC9 定位于 OABLs 的細胞核和炎癥組織的淋巴區(qū)域。在 OABL 的癌旁部位和炎癥的腺體區(qū)域中，DNAJC9 定位于細胞質(zhì)中。大多數(shù) DNAJC9 在淋巴區(qū)域和 OABL 的同一細胞中與 CD20 共表達（圖 6D-E）。與對照組相比，EMZLs 和 DLBCLs 中 DNAJC9 的 MFI 顯著升高。與炎癥相比，OABLs 中 CD20 的 MFI 并不高（圖 6E）。IHC 分析顯示，與炎癥相比，EMZL 中大塊細胞和細胞核的 DNAJC9 染色評分均顯著高于對照（圖 6F-G）。對于 DLBCLs，大塊細胞的染色評分與對照相比沒有顯著提高，而與 EMZLs 相比，細胞核的染色評分顯著降低。這些結(jié)果表明，DNAJC9，尤其是 DNAJC9 的強核染色，是一種潛在的 EMZL 病理診斷標(biāo)志物，可以區(qū)分 EMZL 和炎癥。

圖6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析將 DNAJC9 鑒定為 OABL 的診斷標(biāo)志物

04

研究結(jié)論

該研究提供了一個綜合的基因表達譜，并證明了高全局蛋白質(zhì)-mRNA 一致性是 OABL 的預(yù)后相關(guān)分子特征。作者描繪了 OABL 的選擇性剪接事件景觀，并揭示了 ADAR 的致癌作用，另外，還將 DNAJC9 的強核染色鑒定為結(jié)外邊緣區(qū)淋巴瘤的有希望的病理學(xué)診斷生物標(biāo)志物。

參考文獻：

Shi J, Zhu T, Lin H, Liu Z, Zhou M, Yu Z, Zhou X, Song X, Wang Y, Jia R, Fan X, Zhou Y. Proteotranscriptomics of ocular adnexal B-cell lymphoma reveals an oncogenic role of alternative splicing and identifies a diagnostic marker.?J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jul 30;41(1):234.

博奧晶典科研服務(wù)事業(yè)部 劉瑞明丨文案

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