2023年6月6日，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科金世柱教授團隊在國際知名權(quán)威雜志《Advanced Science》 (Q1，IF=17.521) 發(fā)表題為“From Phenomenon to Essence: A Newly Involved lncRNA Kcnq1ot1 Protective Mechanism of Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells in Liver Cirrhosis”的原創(chuàng)性研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過下調(diào)lncRNA Kcnq1ot1抑制肝星狀細(xì)胞的活化，同時通過調(diào)控 Creb3l1/lncRNA Kcnq1ot1/miR-374-3p/Fstl1抑制肝硬化發(fā)展的重要機制，為未來開發(fā)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化的方案提供了重要線索。

文中使用了來自漢恒生物的腺相關(guān)病毒AAV9及肝實質(zhì)細(xì)胞特異性啟動子TBG，對肝臟中l(wèi)ncRNA Kcnq1ot1進(jìn)行了特異性敲低，推動了相關(guān)實驗研究進(jìn)展。

作者在此前的研究中發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）具有防止肝硬化發(fā)生的功能，并且lncRNA在其中起到了重要作用，但具體機制并不清楚。于是作者利用肝硬化模型對此問題進(jìn)行了研究。首先作者通過CCl4誘導(dǎo)肝硬化并尾靜脈注射BMSCs，進(jìn)行切片染色發(fā)現(xiàn)肝硬化有明顯好轉(zhuǎn)。同時，通過蛋白印跡，作者也觀察到肝硬化的一些標(biāo)志蛋白α-SMA和Col1出現(xiàn)了明顯下降。這說明BMSCs處理確實能有效減輕肝硬化。

圖 1. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）減輕肝硬化，并在體外阻止肝星狀細(xì)胞（HSCs）激活

為了進(jìn)一步探究肝硬化的機制，作者分析了肝硬化相關(guān)的RNA-seq數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)lncRNA Kcnq1ot1在肝硬化的樣品中表達(dá)上調(diào)。同時，人和鼠的肝星狀細(xì)胞激活后，Kcnq1ot1也發(fā)生上調(diào)。更重要的是，BMSCs的處理可使Kcnq1ot1表達(dá)水平出現(xiàn)一定的下降。這說明，BMSCs可能通過抑制Kcnq1ot1來改善肝硬化。為了進(jìn)一步驗證這一結(jié)論，作者在BMSCs處理的樣品中過表達(dá)Kcnq1ot1，發(fā)現(xiàn)肝硬化的一些標(biāo)志蛋白再次上調(diào)，說明BMSCs確實是通過調(diào)控Kcnq1ot1表達(dá)來影響肝硬化過程。

圖 2. Kcnq1ot1的表達(dá)在體內(nèi)外肝硬化過程中均提高，并可被骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所抑制

既然BMSCs主要是通過降低Kcnq1ot1的水平來減輕肝硬化，作者便考慮是否能直接敲低Kcnq1ot1來緩解肝硬化。作者用siRNA來敲低JS1細(xì)胞中的Kcnq1ot1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Kcnq1ot1的敲低能有效抑制JS1細(xì)胞的激活，并降低相關(guān)肝硬化標(biāo)志蛋白的水平。同時，Kcnq1ot1的敲低還抑制了JS1細(xì)胞的增殖。這進(jìn)一步證明了Kcnq1ot1表達(dá)水平在肝硬化中的重要功能。

圖 3. 沉默lncRNA Kcnq1ot1抑制JS1細(xì)胞的增殖和激活

那么BMSCs是如何調(diào)控Kcnq1ot1表達(dá)水平的呢？作者利用starBase 3.0預(yù)測了與Kcnq1ot1結(jié)合的潛在小RNA并發(fā)現(xiàn)了miR-374-3p。通過熒光素酶實驗，作者發(fā)現(xiàn)miR-374-3p能直接結(jié)合Kcnq1ot1。并且，在激活的JS1細(xì)胞中，miR-374-3p的表達(dá)下降，敲低Kcnq1ot1能提高miR-374-3p表達(dá)。而抑制miR-374-3p能提高肝硬化標(biāo)記物，并導(dǎo)致JS1細(xì)胞加快增殖；過表達(dá)miR-374-3p則能降低肝硬化標(biāo)記物表達(dá)，并抑制JS1細(xì)胞增殖。這些結(jié)果說明了miR-374-3p參與了肝硬化的調(diào)控。

結(jié)合starbase3.0網(wǎng)站預(yù)測，作者同時還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)stl1也是miR-374-3p的直接靶標(biāo)，那么Fstl1在肝硬化中是否也有作用呢？作者通過熒光素酶證實了Fstl1與miR-374-3p存在直接相互作用，并且敲低Fstl1也能降低肝硬化相關(guān)標(biāo)記。這說明Fstl1在肝硬化中也有著重要的作用。

圖 4. miR-374-3p 直接與lncRNA Kcnq1ot1 和 Fstl1結(jié)合

為了進(jìn)一步分析Kcnq1ot1 與miR-374-3p 和Fstl1的關(guān)系，作者對Kcnq1ot1 和 miR-374-3p進(jìn)行了敲低。Kcnq1ot1的敲低導(dǎo)致了肝硬化標(biāo)志物和Fstl1的下降，而抑制miR-374-3p能反轉(zhuǎn)這一下降趨勢。過表達(dá)Fstl1能抑制si-Kcnq1ot1的效果。并且miR-374-3p的表達(dá)量與Kcnq1ot1 和 Fstl1的表達(dá)量均呈負(fù)相關(guān)。因此，Kcnq1ot1 通過影響miR-374-3p/Fstl1來抑制肝硬化過程。

圖 5. LncRNA Kcnq1ot1通過miR-374-3p/Fstl1通路調(diào)控JS1細(xì)胞的激活

作者接下來通過JASPAR預(yù)測，并通過實驗證實Creb3l1通過結(jié)合Kcnq1ot1的啟動子來激活Kcnq1ot1的轉(zhuǎn)錄。而BMSCs的處理會降低Creb3l1的表達(dá)。過表達(dá)Creb3l1能增加Kcnq1ot1的表達(dá)，而敲低Creb3l1則增加miR-374-3p并抑制Kcnq1ot1和Fstl1的表達(dá)。這些結(jié)果表明Creb3l1能正向調(diào)控Kcnq1ot1的表達(dá)。

圖 6. Creb3l1正向調(diào)控Kcnq1ot1的轉(zhuǎn)錄

為了驗證Kcnq1ot1治療肝硬化的潛力，作者利用來自漢恒生物的AAV9-TBG 病毒在小鼠體內(nèi)對Kcnq1ot1進(jìn)行了特異性敲低，然后誘導(dǎo)肝硬化的發(fā)生。作者發(fā)現(xiàn)病毒可以高效特異的敲低肝臟內(nèi)的Kcnq1ot1，并有效的減輕了肝硬化程度。

圖 7. 敲低Kcnq1ot1將減輕miR-374-3p/Fstl1在體內(nèi)導(dǎo)致的肝硬化

圖8. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過調(diào)控Creb3l1 / lncRNA Kcnq1ot1 / miR-374-3p / Fstl1 通路減輕肝硬化

最后，作者發(fā)現(xiàn)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過調(diào)控Creb3l1 / lncRNA Kcnq1ot1 / miR-374-3p / Fstl1 通路減輕肝硬化的重要機制，極大的推動了我們對肝硬化發(fā)生機制的理解，為肝硬化的緩解和治療提供了重要的潛在治療靶點。