核酸純化是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，是將DNA和/或RNA從所有其他細(xì)胞和細(xì)胞外成分中分離出來,并且去除細(xì)胞外所有成分和其他干擾物質(zhì)。現(xiàn)在常規(guī)分子診斷中使用的大多數(shù)程序都是基于核酸和硅酸鹽的親和力結(jié)合，同時(shí)洗掉所有其他成分。通過這種方式，可以得到幾乎只含有核酸的純化洗脫液。

以前，核酸研究的金標(biāo)準(zhǔn)是苯酚-氯仿-異戊醇萃取。但現(xiàn)在通過Boom法，花費(fèi)的時(shí)間更少且足夠有效。
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苯酚氯仿抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白質(zhì)的變性劑，反復(fù)抽提，使蛋白質(zhì)變性，SDS(十二烷基磺酸鈉)將細(xì)胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白質(zhì)或多肽或小肽分子，變性降解核蛋白，使DNA從核蛋白中游離出來。而DNA易溶于水，卻不溶于有機(jī)溶劑。蛋白質(zhì)分子表面帶有親水基團(tuán)，也容易進(jìn)行水合作用，并在表面形成一層水化層，使蛋白質(zhì)分子能順利地進(jìn)入到水溶液中形成穩(wěn)定的膠體溶液。當(dāng)有機(jī)溶液存在時(shí)，蛋白質(zhì)的這種膠體穩(wěn)定性遭到破壞，變性沉淀。離心后有機(jī)溶劑在試管底層(有機(jī)相)，DNA存在于上層水相中，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。利用萃取原理，根據(jù)蛋白核酸溶于不同的試劑層，將槍頭伸入不同液層內(nèi)抽取所需的成分，經(jīng)多次洗滌后獲得純化核酸。

優(yōu)點(diǎn)：成本比較低廉且抑制了DNase的降解作用。

缺點(diǎn)：由于使用了苯酚、氯仿等試劑，毒性較大，長時(shí)間操作對人員健康有較大影響，而且核酸的回收率較低，損失量較大，由于操作體系大，不同實(shí)驗(yàn)人員操作重復(fù)性差，不利于保護(hù)RNA，很難進(jìn)行微量化的操作。

BOOM法

Boom在1990年開發(fā)了一種方法，利用二氧化硅顆粒與核酸的磷酸基團(tuán)形成可逆的鹽橋。通過這種方式，可以從基質(zhì)中捕獲核酸。

這些二氧化硅顆?？梢员浑x心分離，并與分離物中的其他成分分開。丟棄上清液后，可以加入洗滌緩沖液來重新懸浮顆粒，然后再次離心。通過一些清洗和離心步驟，硅酸鹽/DNA復(fù)合物與污染物如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他（大）分子分離，而不像苯酚-氯仿提取那樣使用有毒物質(zhì)。通過將二氧化硅顆粒與各種載體（例如順磁珠）耦合，有可能簡化和自動(dòng)完成洗滌步驟，并相對容易地從復(fù)雜的溶液中分離出DNA。

在洗滌步驟之后，核酸在小體積的低摩爾的緩沖液（含10mM TrisHCl/0.1mM EDTA pH 8.2）中從二氧化硅顆粒中被洗脫出來。純化的核酸可以被定性并立即用于進(jìn)一步的步驟。

如今，Boom方法被納入了自動(dòng)化系統(tǒng)。通過這種方式，許多樣品可以以標(biāo)準(zhǔn)化和無污染的方式被分離出來，這對診斷實(shí)驗(yàn)室來說是至關(guān)重要的。

為了保存核酸分離物，可以將洗脫緩沖液蒸發(fā)掉，得到易于在室溫下保存的固體親水粉末。在使用前，通常將該粉末溶解在相同體積的無核酸酶的水中。另一種方法是將洗脫液冷凍，儲存在-20℃或-80℃。

胡潤 | 文案

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