CRISPR/Cas系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)至今在生物領(lǐng)域掀起了巨大的研究熱潮，目前研究最為深入的是前幾期內(nèi)容介紹的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。隨著應(yīng)用的不斷拓寬，固定的PAM基序以及Cas9蛋白本身特性的一些限制條件，如蛋白大小等，對CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用造成了局限性。越來越多的Cas9變體以及新的核酸內(nèi)切酶被發(fā)掘，以拓寬Cas酶系列研究工具。目前已發(fā)現(xiàn)的Cas酶亞型共計33個，分為2個大類、6個不同類型。今天小編帶來的是近幾年研究正熱的Cas12a蛋白的相關(guān)應(yīng)用，目前Cas12a(Cpf1)與crRNA形成的核糖核蛋白（RNP）直接轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的方法具有更安全、更快、脫靶效應(yīng)更低、編輯效率更高等優(yōu)點(diǎn)。

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圖1.?兩類CRISPR/Cas系統(tǒng)，圖片來源Makarova KS?et al,?2020

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CRISPR/Cas12屬于2類V型RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶。該蛋白家族中研究較多是Cas12a核酸酶，目前最常用的Cas12a蛋白來自氨基酸球菌屬的BV3L6菌株和毛螺科細(xì)菌(LbCas12a)。Cas12a蛋白已被廣泛應(yīng)用于包括細(xì)菌、酵母、植物和人類細(xì)胞在內(nèi)的多個物種。

Cas12a蛋白由向?qū)NA引導(dǎo)剪切帶有特異性序列的雙鏈dna(dsDNA)。與Cas9蛋白一樣，Cas12a蛋白結(jié)構(gòu)可細(xì)分為REC和NUC葉，不同的是Cas12a蛋白的NUC葉缺少HNH結(jié)構(gòu)域，但含有RuvC結(jié)構(gòu)域，用于DNA切割。此外，NUC葉有一個楔形結(jié)構(gòu)域和一個“核酸酶”（NUC）結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域不能切割DNA。AsCas12a蛋白含有1307個氨基酸，大小與SpCas9蛋白相當(dāng)。

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圖2.?AsCas12a結(jié)構(gòu)域示意圖，圖片來源：Yamano T al et，2016

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Cas12蛋白的作用機(jī)制

在機(jī)制上，與Cas9蛋白不同，Cas12a蛋白不需要tracrRNA進(jìn)行pre-crRNA加工，也不需要RNaseIII。Cas12a的WED結(jié)構(gòu)域中存在核糖核酸酶位點(diǎn)，允許將pre-crRNA自主加工為成熟的crRNA。Cas12a的crRNA明顯短于Cas9向?qū)NA（sgRNA或crRNA+ tracrRNA）。這允許緊湊的Cas12a CRISPR陣列，可用于同時靶向多個位點(diǎn)。

Cas12蛋白只需要識別crRNA就能有效切割單鏈DNA和雙鏈DNA。Cas12蛋白的RuvC和核酸酶葉(NUC)結(jié)構(gòu)域具有裂解活性。與Cas9相同，Cas12a在PAM（5’-TTTV-3’， V為A/C/G）序列旁邊存在一個潛在靶點(diǎn)，一旦與Cas12相遇，就可以啟動R-loop，在crRNA和目標(biāo)DNA鏈之間形成堿基對雜交，匹配目標(biāo)序列的1～17個堿基對，形成R-loop。一旦R-loop形成，Cas12a蛋白利用其活性RuvC結(jié)構(gòu)域，在PAM序列的幫助下切割非目標(biāo)鏈。Cas12a蛋白的切割功能被激活后，會切割周圍的非特異性單鏈DNA，這種現(xiàn)象被稱之為反式切割。

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圖3. CRISPR/Cas12機(jī)制示意圖。圖片來源：Swarts DC al et, 2017

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與Cas9產(chǎn)生平末端相比，Cas12a產(chǎn)生交錯粘性末端可能更有利于以精確方向整合DNA序列等應(yīng)用。CRISPR-Cas12a基因編輯系統(tǒng)可作為Cas9系統(tǒng)的極大補(bǔ)充，甚至在某些編輯領(lǐng)域中比Cas9系統(tǒng)更具優(yōu)勢。

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圖4.Cas12a與Cas9作用形成的端口，圖片來源：Barrangou R al et，2017

Cas12a系統(tǒng)的優(yōu)勢：

a. CRISPR-Cas12a系統(tǒng)拓展了CRISPR-Cas9系統(tǒng)不可用的編輯位點(diǎn)，且能在序列5’端產(chǎn)生交錯切割。這相比CRISPR-Cas9系統(tǒng)，顯著增加了細(xì)胞選用同源重組修復(fù)（HDR）方式的概率，提升了基因編輯效率。

b. Cas12a識別富含胸苷的PAM 序列，能夠在具有豐富AT基因組的生物體中進(jìn)行基因組編輯，比CRISPR-Cas9系統(tǒng)更具廣泛的序列編輯范圍。

c. 只需要crRNA與Cas12a蛋白的簡單復(fù)合而不需要tracrRNA，且Cas12a的crRNA較短，一般在40-44nt左右（包含一個20nt的恒定區(qū)和一個20-24nt的特異性結(jié)合區(qū)域），更有利于化學(xué)合成。

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Cas12a蛋白的應(yīng)用

CRISPR/Cas診斷工具，稱為基于Cas12a蛋白的DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR反式報告基因(DETECTR)。DETECTR技術(shù)使用V型酶（如Cas12a）切割單鏈DNA序列，分為三個階段：（1）將Cas12a蛋白和靶crRNA整合進(jìn)DNA報告探針中，一旦crRNA通過Cas12a蛋白識別其靶序列，Cas12a蛋白就會在激活切割能力后，靶向切割單鏈或雙鏈DNA；（2）靶DNA探針與熒光團(tuán)和猝滅分子結(jié)合；（3）DNA探針降解釋放熒光團(tuán)和猝滅劑，產(chǎn)生強(qiáng)大的熒光信號，用于檢測靶向單鏈或雙鏈DNA的切割情況。該系統(tǒng)甚至可以檢測到單個病毒顆粒分子。例如，DETECTR被用于檢測SARS-Cov-2病毒。Mammoth Biosciences公司以SARS-Cov-2病毒的兩個核衣殼（N）和包膜（E）基因?yàn)榘悬c(diǎn)，在1小時內(nèi)更快地檢測到了病毒，生成特異性靶向SARS-CoV-2的Cas12a-gRNA，并優(yōu)化了E和N基因的DETECTR檢測。研究結(jié)果表明，基于CRISPR/Cas12系統(tǒng)可高效、快速診斷COVID-19。Cas12核酸酶的這些應(yīng)用使科學(xué)家們能夠擴(kuò)大基因組編輯在各個領(lǐng)域的范圍，包括診斷新型病毒。

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圖5. DETECTR系統(tǒng)機(jī)理圖，圖片來源：Fang L al et, 2023（RPA：重組酶聚合酶擴(kuò)增）

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用于基因組編輯的CRISPR/Cas12系統(tǒng)的快速發(fā)展，對生命科學(xué)具有重要意義。盡管這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域很廣泛，但CRISPR/Cas12系統(tǒng)仍存在一些缺陷。例如，盡管該系統(tǒng)被證明在HDR型DNA修復(fù)方面占據(jù)很大的優(yōu)勢，但其有效性仍取決于細(xì)胞類型。通過HDR的DNA修復(fù)通常與細(xì)胞分裂有關(guān)，這使得這些基因編輯工具在分裂不活躍的細(xì)胞（如神經(jīng)元）中工作效率低下。但該系統(tǒng)具備的廣泛適用性，使有關(guān)于Cas12a以及其他Cas12家族成員的相關(guān)研究數(shù)量都正處于高量上升的狀態(tài)。

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