單個B細胞抗體制備---艾柏森生物
1. 鑒定和分離單個B?細胞
細胞來源：外周血中分離漿細胞；外周血中分離單個記憶B?細胞；骨髓中分離前B?細胞。
在樣品豐富的情況下，為提高特異性抗體得率，可以在分離B?細胞之前先通過密度梯度法，或流式細胞分選從外周血中粗分離B淋巴細胞，以ELISPOT?進行抗原特異性細胞豐度的評價，從而選擇含抗原特異性抗體濃度較高的血樣進行后續(xù)抗體制備。
單個B?細胞分離可分隨機分離和抗原特異性分離，前者只需分離B?細胞，操作簡單，適用于抗原特異性抗體濃度較高的血樣，通常來自于疫苗接種者或患者，以盡量減輕后續(xù)抗體特異性鑒定的工作量。后者需分離抗原特異性B?細胞，操作較復雜，尤其適合抗腫瘤抗體、自身免疫抗體等特異性抗體含量較低的情況。
Table 1 Approaches of single B cell isolation
Approaches
Advantages
Disadvantages
Random
isolation
Micromanipulation
Low equipment requirements
Simple operation
Low efficiency
Limited types of isolated
cells
Laser capture
microdissection
High position accuracy
Simple operation
Low efficiency
Complicated process of
sample preparation
Fluorescence-activated cell
sorting
High accuracy and efficiency
High degree of automation
Complicated operation
High equipment
requirements
Antigenselective
isolation
Fluorochrome-labeled
antigens via multiparameter
High accuracy and efficiency
High degree of automation
High-throughput and multiparameter
Capability of isolating B
cells at different stages
Complicated operation
High equipment
requirements
Antigen-coated magnetic
beads
High purity
Mostly used in pre-isolation
of fluorescence-activated cell
sorting
High cost
Limited bioactivities
Microengraving/Cell-based
micro-array chip systems
High accuracy and efficiency
Low cost
Early and rapid identification
of antibody-secreting cells
Complicated operation
2. 擴增和克隆抗體基因
細胞分選時，通常需將單個B?細胞分至內含適量細胞裂解液、RNA?酶抑制劑和PCR?反應試劑的適當容器中，如96?孔板。由于單個細胞內RNA?含量少，適當?shù)娜萜骺梢苑奖愦笈坎僮?、防止樣品損失或交叉污染。另外，不同類型B?細胞抗體分泌能力差異明顯，如抗體分泌B?細胞中抗體基因轉錄本含量遠高于記憶B?細胞，因此從抗體分泌B?細胞中更容易擴增得到抗體基因。
通常從單個B?細胞中擴增未知抗體基因，需使用合適的引物進行巢式或半巢式逆轉錄PCR(Nested or semi-nested RT-PCR)，該過程要求引物具有通用性、靈敏性、特異性，能避免非特異性擴增又能擴增出完整的抗體基因序列，因此合理設計引物序列至關重要。通常針對抗體重鏈輕鏈可變區(qū)不同前導序列設計前向引物的混合物，反向引物特異性互補于抗體恒定區(qū)。根據(jù)實驗目的，如果分離和擴增不同同種型的抗體，反向引物則是特異性互補于各種同種型抗體恒定區(qū)的混合物。
Ozawa?等通過5’ RACE (5’ rapid amplification of cDNA ends)?方法成功擴增出抗體基因編碼框5’端的完整序列，該方法通過針對不同同種型抗體恒定區(qū)保守序列的特異性反向引物序列GSP?引物（Gene-Specific Primer）混合物，?直接從細胞中RT-PCR?合成cDNA?第一鏈，對第一鏈加多聚G尾后（通過末端脫氧核苷酸轉移酶TdT實現(xiàn)），繼續(xù)用一條帶有下游巢式PCR?引物互補序列和多聚C?的前向引物AP?合成第二鏈，進而利用針對AP?和恒定區(qū)保守序列的特異性引物混合物進行兩步巢式PCR，更加特異地擴增出目的基因。傳統(tǒng)的5’ RACE?法擴增未知基因的細胞含量要求較高，Ozawa?提出的單個B?細胞5’ RACE材料要求少至僅需一個細胞，且可能擴增出多種前向引物混合物PCR?的方法無法擴增出的抗體基因，另外過程中無需純化PCR?產(chǎn)物，省略了復雜的前向引物混合物，大大簡化了反應體系。
備注：末端脫氧核苷轉移酶?TdT是一種模板非依賴型DNA聚合酶，催化在寡核苷酸、單鏈和雙鏈DNA的3’-OH重復添加脫氧核糖核苷酸。也就是說添加的這段序列是由我們給與的dNTP原料來決定的。
擴增出的抗體基因片段連接成scFv、scAb、Fab等形式，酶切將其構建到原核或者真核表達載體中。
3. 表達、篩選和鑒定抗原特異性抗體
鑒定抗體的抗原特異性和生物活性前需將攜帶有抗體基因的表達載體在相應系統(tǒng)中表達，最簡單常用的是原核表達系統(tǒng)，如Escherichia coli，相較而言，真核表達系統(tǒng)尤其是哺乳動物細胞表達系統(tǒng)更有利于抗體的加工修飾，其產(chǎn)物的生物活性可靠性更高，常用的有HEK293和CHO等細胞系。
