前言

神經(jīng)軸突再生速率在哺乳動(dòng)物外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷后受到限制。運(yùn)動(dòng)和環(huán)境富集等因素可以促進(jìn)軸突再生的信號(hào)通路。間歇性禁食（IF）可激活基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成、線(xiàn)粒體代謝和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素釋放。然而，IF是否影響軸突再生能力仍有待研究。本篇以小鼠坐骨神經(jīng)為對(duì)象，探究腸道細(xì)菌衍生代謝物吲哚-3-丙酸（IPA）對(duì)神經(jīng)軸突的再生作用和恢復(fù)功能。

2022年06月，英國(guó)倫敦帝國(guó)學(xué)院腦科學(xué)系神經(jīng)學(xué)部的Simone Di Giovanni 教授課題組在Nature（IF:69.504）期刊發(fā)表了題為 “The gut metabolite indole-3 propionate promotes nerve regeneration and repair ”的研究成果，通過(guò)GC-MS非靶向代謝組學(xué)、LC-MS/MS、16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序、RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、免疫學(xué)等研究方法，發(fā)現(xiàn)了小鼠腸道菌群和代謝物特征，探究了神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)理，描繪了損傷神經(jīng)的再生和增加圖譜，為小鼠的神經(jīng)軸突再生和感覺(jué)功能恢復(fù)理論依據(jù)。

研究思路

研究方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組

• IF組：C57BL/6小鼠，6-8只，雄性

• AL組：C57BL/6小鼠，6-8只，雄性

  
  

2. 技術(shù)路線(xiàn)

• GC-MS非靶向代謝組學(xué)：分析血清

• LC–MS/MS：分析IPA和血漿

• 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序：盲腸內(nèi)容物

• 16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序：糞便DNA

• RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：DGR樣本

• 免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)：采用顯微鏡分析DRG，計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量，測(cè)量背景強(qiáng)度或計(jì)算陽(yáng)性染色的細(xì)胞百分比

  
  

3. 統(tǒng)計(jì)分析

雙尾非配對(duì)S-t檢驗(yàn)、單因素方差分析、Tukey或Sidak多重比較檢驗(yàn)的雙向方差分析、Mann–Whitney U檢驗(yàn)、Wald 檢驗(yàn)

研究結(jié)果

1. IF通過(guò)腸道微生物群促進(jìn)的再生功能

SNC造模72小時(shí)后，與AL喂養(yǎng)組相比，IF喂養(yǎng)組的坐骨神經(jīng)軸突再生速度顯著更快（圖1a-c和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1a-c）。IF并未改變軸突再生的關(guān)鍵細(xì)胞（如施萬(wàn)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞），也沒(méi)改變DRG中的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度。由此推測(cè)，施萬(wàn)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并未在IF促進(jìn)軸突再生的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1d-k）。

圖1|IF通過(guò)影響腸道微生物群促進(jìn)軸突再生代謝物

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1|間歇性禁食促進(jìn)軸突再生和DRG軸突生長(zhǎng)坐骨神經(jīng)損傷后IF和AL神經(jīng)和DRG巨噬細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的評(píng)估

代謝變化可能是IF依賴(lài)性再生能力的基礎(chǔ)。小鼠接受IF和AL喂養(yǎng)后，提取的血清進(jìn)行GC-MS非靶向代謝組學(xué)分析。并識(shí)別出79種代謝物，其中14種在IF喂養(yǎng)后富集（圖1d-f和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2a-c）。這些代謝物可分為兩組：微生物群衍生代謝物和宿主代謝物，富集多的是微生物衍生代謝物（3-吲哚乳酸、2,3-丁二醇、 IPA、木糖）和IPA（圖1e-f），而這4種代謝物均與宿主代謝物無(wú)關(guān)。IF喂養(yǎng)方式改變了小鼠的飲食與代謝狀態(tài)，繼而觸發(fā)/促進(jìn)軸突再生。IF喂養(yǎng)的小鼠腸道菌群移植到AL喂養(yǎng)小鼠體內(nèi)后，AL喂養(yǎng)小鼠在SNC造模后神經(jīng)再生的速度顯著加快。

圖2 | IPA通過(guò)腸道革蘭氏陽(yáng)性微生物的依賴(lài)機(jī)制，促進(jìn)IF軸突再生

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2 |O-PLS-DA模型使用基于GC-MS代謝譜以區(qū)分含與不含萬(wàn)古霉素的AL組和IF組,IF小鼠糞便微生物群移植促進(jìn)軸突再生

IPA是受萬(wàn)古霉素顯著影響的代謝物（圖2e-k和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2g-j）。使用萬(wàn)古霉素顯著降低了革蘭氏陽(yáng)性菌（雙歧桿菌、乳桿菌和生孢梭菌等能產(chǎn)生吲哚代謝物）的豐度，減少小鼠腸道菌群的多樣性（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3a-c和補(bǔ)充數(shù)據(jù)2-3），IF促進(jìn)軸突再生的能力也被削弱。雙向結(jié)果均提示革蘭氏陽(yáng)性菌可能是IF促進(jìn)軸突再生的關(guān)鍵所在。為證實(shí)萬(wàn)古霉素對(duì)IF依賴(lài)性途徑的影響，采用了Piphillin軟件進(jìn)行基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4和補(bǔ)充數(shù)據(jù)4）。色氨酸合成酶（TrpA）的IF依賴(lài)性富集，是將吲哚-3-甘油磷酸轉(zhuǎn)化為吲哚（補(bǔ)充數(shù)據(jù)4），而萬(wàn)古霉素則是消除了這種富集。

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3 |16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序顯示間歇性禁食后梭菌數(shù)量

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4 | Piphillin分析顯示特定代謝途徑的豐度增加

2. IPA通過(guò)中性粒細(xì)胞的趨化作用增強(qiáng)修復(fù)功能

萬(wàn)古霉素的介入導(dǎo)致革蘭氏陽(yáng)性菌耗竭。C.s.fldC菌株或C.s.野生型（WT）菌株對(duì)腸道進(jìn)行重新克隆，觀察72h后SNC軸突再生情況（圖3a-d）。用C.s.fldC重新克隆的小鼠血清，因?yàn)槿コ薎PA，導(dǎo)致軸突再生顯著減少（圖3b-d）。

每天灌胃20mg/kg IPA，顯著增加了坐骨神經(jīng)的軸突再生（圖3e-h），而低劑量的IPA（10mg/kg）卻不影響坐骨神經(jīng)軸突的再生功能（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5a-c）。血清和DRG的時(shí)間生物利用度曲線(xiàn)顯示，12h內(nèi)采集的IPA持續(xù)增加20?min。灌胃后1?h和6 h，DGR中的IPA濃度仍較高（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5d-e）。腹腔注射給藥IPA，評(píng)估SNC 72h后的軸突再生情況，發(fā)現(xiàn)血清中的IPA引起了神經(jīng)元的增加和生長(zhǎng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5f-h）。

差異基因表達(dá)分析表明，IPA影響了DRG基因表達(dá)程序（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a-c）。編碼IPA核受體PXR（Nr1i2）的基因表達(dá)增加（擴(kuò)展數(shù)據(jù)5）。特別是IPA影響了與免疫調(diào)節(jié)基因本體（GO）類(lèi)別相關(guān)的基因，其中顯著的是中性粒細(xì)胞趨化性（圖4a-b）。IPA選擇性上調(diào)Cd177和Cxcl1，可能是通過(guò)CXCR2的介導(dǎo)，而促進(jìn)中性粒細(xì)胞向DRG趨化。IPA治療增加了DRG組織內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量，但在神經(jīng)擠壓部位沒(méi)有增加（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6d-k和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7）。接受IPA的小鼠和對(duì)照組小鼠的免疫細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有差異（擴(kuò)展數(shù)據(jù)8）。用抗Ly6G單克隆抗體去除中性粒細(xì)胞，顯著減少了IPA介導(dǎo)的軸突再生（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7和9a-k）。值得注意的是，PXR缺失減少了中性粒細(xì)胞的數(shù)量和IPA依賴(lài)性再生，其程度與抗Ly6G單克隆抗體相似（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9j-n）。

中性粒細(xì)胞可能是被CXCL1受體CXCR2的介導(dǎo)機(jī)制所激活（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10a-b）。而抗CXCR2單克隆抗體，則損害了IPA依賴(lài)性的再生（圖4c-g和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10c-d）。

RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，DRG中IPA依賴(lài)的干擾素γ (IFNγ) 信號(hào)通路增加 (擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖11)。為促進(jìn)DRG神經(jīng)元再生生長(zhǎng)，可體內(nèi)注射IFNγ(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖11d-e)。IFNγ 在DRG神經(jīng)元胞體中表達(dá)，但在軸突中不表達(dá)。體內(nèi)單獨(dú)傳遞IFNγ可以增加DRG中幾種再生信號(hào)的表達(dá)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖11h-k)。

圖3 |IPA促進(jìn)SNC后DRG神經(jīng)元的軸突再生

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5 |吲哚-3-丙酸依賴(lài)性軸突再生??

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6 | IPA治療損傷后的DRG進(jìn)行 RNA測(cè)序，IPA治療后DRG中性粒細(xì)胞增多

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7 |FACS控制策略?

?擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖8 | IPA和PBS處理后的免疫細(xì)胞定量，包括SNC后3天

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖9 | PXR KO小鼠中性粒細(xì)胞減少后，再生減少?

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖10 | IPA治療后CXCR2+中性粒細(xì)胞增多，神經(jīng)組織抗CXCR2抗體減少

擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖11 | SNC發(fā)生后IFNy是IPA依賴(lài)性軸突再生的所需物，DRG神經(jīng)元中增加了RAG的磷酸化與表達(dá)

3. IPA提高修復(fù)功能和皮膚神經(jīng)支配功能

通過(guò)熱刺激反應(yīng)評(píng)估生理感覺(jué)功能的恢復(fù)，機(jī)械性異常疼痛，可能是表皮神經(jīng)支配不良的后果（圖4g-j）。通過(guò)解剖觀察，熱傷害后，IPA不誘發(fā)坐骨神經(jīng)損傷后的機(jī)械性異常疼痛，可通過(guò)改善表皮神經(jīng)支配而誘導(dǎo)感覺(jué)功能的恢復(fù)（圖4k-m）。

圖4 | 依賴(lài)IPA的軸突再生需要中性粒細(xì)胞趨化、加速熱感覺(jué)恢復(fù)和表皮神經(jīng)支配

相關(guān)討論

間歇性禁食（IF）促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)擠壓后的軸突再生，這種機(jī)制依賴(lài)于革蘭氏陽(yáng)性腸道微生物組和血清中腸道細(xì)菌衍生代謝物吲哚-3-丙酸 (IPA) 的增加。芽胞桿菌產(chǎn)生的IPA是有效的軸突再生必需物，在坐骨神經(jīng)損傷后遞送IPA，顯著增了強(qiáng)軸突再生，加速感覺(jué)功能的恢復(fù)。坐骨背根神經(jīng)節(jié)的RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明，中性粒細(xì)胞趨化性在IPA依賴(lài)性再生表型中起了作用，并通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞趨化得到證實(shí)。人體腸道菌群中也存在著生孢梭菌及其代謝物IPA，但這一機(jī)制對(duì)人體的適用性，仍需臨床試驗(yàn)研究。

研究結(jié)論

革蘭氏陽(yáng)性腸道菌群生孢梭菌及代謝物吲哚-3-丙酸（IPA），通過(guò)免疫介導(dǎo)促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)損傷后的神經(jīng)軸突再生和感覺(jué)功能的恢復(fù)。間歇性禁食（IF）能夠改變腸道菌群活性，促進(jìn)IPA的產(chǎn)生并影響機(jī)體新陳代謝，而促進(jìn)神經(jīng)軸突再生、加速感覺(jué)功能恢復(fù)。

本篇文章運(yùn)用通過(guò)GC-MS非靶向代謝組學(xué)、LC-MS/MS、16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序、RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、免疫學(xué)揭示了間歇性禁食（IF）促進(jìn)神經(jīng)再生的潛在機(jī)制，及腸道菌群干預(yù)軸突再生的機(jī)制。通過(guò)對(duì)IPA的進(jìn)一步研究，為細(xì)菌代謝物治療神經(jīng)性疾病及相關(guān)疾病奠定了基礎(chǔ)。

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