雜質(zhì)研究是小分子原料藥質(zhì)量研究的一個重要組成部分。ICH在Q3指導(dǎo)原則與M7指導(dǎo)原則中，著重介紹了原料藥雜質(zhì)研究的技術(shù)細節(jié)。[1]本篇文章對于Q3、M7指導(dǎo)原則的相關(guān)內(nèi)容進行概括性地介紹，也是本教材的最后一篇內(nèi)容。

ICH Q3指導(dǎo)原則分為四部分，它們分別是：Q3A（原料藥中的雜質(zhì)概述、有機雜質(zhì)）、Q3B（制劑中的雜質(zhì)概述）、Q3C（溶劑殘留）、Q3D（元素雜質(zhì)）。ICH M7指導(dǎo)原則著重介紹基因毒性雜質(zhì)的判定與控制策略。我們在本文中分小節(jié)逐次介紹除Q3B指導(dǎo)原則以外的其他所有主題。

1.?????ICH Q3A–原料藥中的雜質(zhì)概述、有機雜質(zhì)

1.1?原料藥中的雜質(zhì)概述

在Q3A指導(dǎo)原則中，雜質(zhì)被分為了三大類：與工藝和藥物結(jié)構(gòu)相關(guān)的有機雜質(zhì)、無機雜質(zhì)、殘留溶劑。[2]需要注意的是，Q3A并沒有對于存在于小分子原料藥的規(guī)格中的所有雜質(zhì)進行討論，這包括：外源性污染物（如微生物與內(nèi)毒素）、多晶型（polymorph）、對映異構(gòu)體雜質(zhì)。

1.2?有機雜質(zhì)–特定雜質(zhì)與非特定雜質(zhì)

對于有機雜質(zhì)而言，它的來源包括：1）起始物料；2）工藝過程中的副產(chǎn)物；3）工藝過程中的中間體；4）原料藥與其他雜質(zhì)的降解產(chǎn)物；5）試劑、配體、催化劑。除了在工藝化學(xué)研發(fā)階段獲得原料藥有機雜質(zhì)的主要信息之外，原料藥穩(wěn)定性測試[3]之中的降解產(chǎn)物、強降解產(chǎn)物也需要被雜質(zhì)研究關(guān)注。

理論上，一個原料藥在生產(chǎn)純化之后，攜帶的在1 ppm級別以上的有機雜質(zhì)種類非常多，但不是所有有機雜質(zhì)都需要在規(guī)格上單獨列出、在放行過程中單獨檢測。因此，根據(jù)是否單獨列入規(guī)格的檢測項，我們可以對于各種雜質(zhì)區(qū)分為：特定雜質(zhì)（Specified Impurity）與非特定雜質(zhì)（Unspecified Impurity）。[4]

特定雜質(zhì)與工藝過程有穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)性，引起研發(fā)過程的持續(xù)關(guān)注：通常情況下，特定雜質(zhì)都是已鑒定雜質(zhì)，但單獨出現(xiàn)在規(guī)格檢測項里面并不意味著必須將其成功鑒定。對于非特定雜質(zhì)而言：它們在原料藥產(chǎn)品中存在的種類、概率、量級（對于原料藥而言，非特定雜質(zhì)含量一定要小于鑒定限度）很??；且人們通過安全性研究，可以判斷這些非特定雜質(zhì)足夠安全。

對于非特定雜質(zhì)，在規(guī)格中也可以將其稱為單項雜質(zhì)（Single Impurities）對其限度進行統(tǒng)一控制：例如，技術(shù)人員對某中間體的規(guī)格有一項“單項雜質(zhì)不大于0.5%”的描述，其含義就是“所有非特定雜質(zhì)HPLC純度均不大于0.5%”。

1.3?有機雜質(zhì)–報告限度、鑒定限度、界定限度[5]

對于原料藥中的雜質(zhì)，人們會根據(jù)原料藥的每日攝入量（Total Daily Intake，TDI）設(shè)定三個限度：報告限度（Reporting Threshold）、鑒定限度（Identification Threshold）、界定限度（Qualification Threshold）。ICH Q3A的附件一明確了根據(jù)不同TDI設(shè)定的三個限度的數(shù)值。

對于超出報告限度的雜質(zhì)，均應(yīng)在檢測報告中報告該雜質(zhì)的具體數(shù)值。對于超出鑒定限度的雜質(zhì)，均應(yīng)對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。

對于超出界定限度的雜質(zhì)，一般人們認為該雜質(zhì)對使用者的健康有安全性的顧慮。這時，研究主體需要對該雜質(zhì)進行安全性的進一步研究：[6]或使用純化手段將雜質(zhì)水平降至安全限度以下、或經(jīng)過安全性試驗證明該雜質(zhì)水平即便較高也不會產(chǎn)生風(fēng)險，兩種方式均可使原料藥產(chǎn)品質(zhì)量得到控制。關(guān)于更詳細的雜質(zhì)控制策略，ICH Q3A的附件三明確了對于雜質(zhì)鑒定和界定相關(guān)的決策樹。

1.4?在質(zhì)量標準中的雜質(zhì)檢測項目（ICH Q3A第6節(jié)）

ICH Q3A對于小分子原料藥規(guī)格里，雜質(zhì)的檢測項目做了明確說明：以下是ICH Q3A的原文摘錄。

新原料藥質(zhì)量標準中應(yīng)包括以下雜質(zhì)檢查項：

1）有機雜質(zhì)：每種特定的已鑒定雜質(zhì)、每種特定的未鑒定雜質(zhì)、任何不大于(≤)鑒定限度的非特定雜質(zhì)、雜質(zhì)總量；

2）殘留溶劑；

3）無機雜質(zhì)。

2.?????ICH Q3C–殘留溶劑

ICH Q3C指導(dǎo)原則將殘留溶劑定義為：在原料藥或輔料的生產(chǎn)中、以及制劑制備過程中，使用或產(chǎn)生的有機揮發(fā)性化合物。人們對于工藝路線中常用的溶劑類型，都收集了足夠充分的毒理學(xué)數(shù)據(jù)、從而推導(dǎo)出相應(yīng)的每日允許暴露量（Permitted Daily Exposure，PDE）。根據(jù)溶劑對于人體和環(huán)境的危害程度，工藝路線中常用的溶劑被分類為1類、2類、3類溶劑。

1類溶劑是應(yīng)在工藝過程中避免的溶劑：它們是已知的人體致癌物、強疑似人體致癌物、環(huán)境危害物。1類溶劑包含：苯、四氯化碳、1,2-二氯甲烷、1,1-二氯乙烯、1,1,1-三氯乙烷。如果在工藝中不得不使用這些溶劑，它們在原料藥產(chǎn)品中的濃度限度（除1,1,1-三氯乙烷外）均在10 ppm以下。

2類溶劑是應(yīng)限制的溶劑：它們是非遺傳毒性動物致癌物、可能導(dǎo)致其他不可逆毒性（如神經(jīng)毒性或致畸性）的溶劑、可能有其他嚴重但可逆的毒性的溶劑。應(yīng)限制2類溶劑在制劑中的使用。對于原料藥而言，如果在工藝路線中使用了2類溶劑，則原料藥檢測標準中的2類溶劑殘留都有相應(yīng)的濃度限度。ICH Q3C在其4.2節(jié)說明了每種2類溶劑的濃度限度。

3類溶劑可視為低毒、對人類健康危害風(fēng)險較低的溶劑。如果工藝路線允許，應(yīng)盡量在工藝過程中使用3類溶劑。在原料藥檢測標準中，通常無需將特定類型的3類溶劑標明：所有3類溶劑加和含量占比小于0.5%（5000 ppm）即符合安全性標準。

舉個例子，如果一條工藝路線在合成原料藥的過程中使用了兩種2類溶劑（乙腈、甲醇），使用的其他溶劑均為3類溶劑。則原料藥標準關(guān)于殘留溶劑的規(guī)格設(shè)置可以這樣考慮：乙腈（410 ppm，GC方法測定）、甲醇（3000 ppm，GC方法測定）、干燥失重不大于0.5%。

3.?????ICH Q3D–元素雜質(zhì)

在生產(chǎn)原料藥的過程中，元素雜質(zhì)的來源包括：原料藥工藝過程（如金屬催化劑）、生產(chǎn)過程中使用的水與輔料、包裝材料、生產(chǎn)設(shè)備等。[7]元素雜質(zhì)與殘留溶劑類似，根據(jù)每日允許暴露量（PDE），被分類為1類、2類、3類元素雜質(zhì)。

與殘留溶劑不同的是：藥品如果對于人體的給藥路徑（口服、注射、吸入）的不同，元素雜質(zhì)在人體中的生物利用度不一樣。因此，在不同的給藥路徑前提下，同一種元素雜質(zhì)在規(guī)格標準中的限度是不一樣的。[8]

1類元素雜質(zhì)在自然界有一定程度的豐度，且為人體毒素。除了在工藝路線中避免使用這些元素之外，也要考察相關(guān)元素雜質(zhì)所有潛在的來源。1類元素雜質(zhì)包含：砷（As）、鎘（Cd）、汞（Hg）、鉛（Pb）。

2類元素雜質(zhì)通常被認為是給藥途徑依賴型的人體毒素。2A類元素在自然界有一定程度的豐度，因此對所有潛在來源以及給藥途徑都需要進行風(fēng)險評估。2A類元素包含：鈷（Co）、鎳（Ni）、釩（V）。2B類元素在自然界的豐度較低，如不是在生產(chǎn)過程中刻意添加這些元素，通常無需進行風(fēng)險評估。2B類元素包含：銀（Ag）、金（Au）、銥（Ir）、鋨（Os）、鈀（Pd）、鉑（Pt）、銠（Rh）、釕（Ru）、硒（Se）、鉈（Tl）。

3類元素口服給藥途徑的毒性相對較低，但在吸入和注射給藥途徑的風(fēng)險評估中仍需考慮。除非有意添加這些元素，否則在口服給藥途徑的風(fēng)險評估中不需考慮。3類元素包含：鋇（Ba）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鋰（Li）、鉬（Mo）、銻（Sb）、錫（Sn）。

在ICH Q3D指導(dǎo)原則中，表5.1詳細闡述了在各給藥路徑條件下，上述三類元素雜質(zhì)是否需要進行相關(guān)的風(fēng)險評估；附錄2介紹了上述三類元素雜質(zhì)在各給藥路徑下的每日允許暴露量；而由每日允許暴露量與相應(yīng)的原料藥/制劑每日攝入量的比值，可以直接得出每個元素雜質(zhì)在原料藥/制劑的規(guī)格標準中的濃度限度。

4.?????ICH M4–基因毒性雜質(zhì)

在原料藥的有機雜質(zhì)之中，有一類雜質(zhì)在進入人體之后，可能會與人體的DNA發(fā)生反應(yīng)，從而增加使用者患癌癥的概率。這類雜質(zhì)被稱作潛在基因毒性雜質(zhì)，或是基因毒性雜質(zhì)（Genotoxic Impurities，GTI）。2018年，華海藥業(yè)的纈沙坦原料藥被檢測出含有N-亞硝基二甲胺（NDMA）的基因毒性雜質(zhì)，[9]引發(fā)了業(yè)界對于原料藥基因毒性雜質(zhì)、特別是亞硝胺類雜質(zhì)的又一輪關(guān)注。[10]

4.1?每日允許暴露量（PDE）應(yīng)用于基因毒性雜質(zhì)的控制策略

對于基因毒性雜質(zhì)的控制策略，ICH在M7指導(dǎo)原則中專門進行了描述，以作為Q3A、Q3B信息的必要補充。

在Q3C的信息中，我們已經(jīng)介紹了每日允許暴露量（PDE）應(yīng)用于殘留溶劑的控制策略。溶劑本質(zhì)上也是一類有機雜質(zhì)，對Q1A中描述的于有機雜質(zhì)，我們也可以根據(jù)它們的毒理學(xué)數(shù)據(jù)判斷相應(yīng)的PDE，進而推導(dǎo)出合理的控制限度；而且，無論該有機雜質(zhì)是不是基因毒性雜質(zhì)，PDE應(yīng)用于確定控制限度的策略均適用。只不過很多Q1A描述的、伴隨工藝產(chǎn)生的有機雜質(zhì)千變?nèi)f化（且雜質(zhì)水平隨工藝控制策略的變化而變化），人們有時候無法獲得足夠多、足夠純的雜質(zhì)做比較透徹的毒理學(xué)研究。

4.2?以輔助性預(yù)測方式對基因毒性雜質(zhì)進行控制

對于伴隨工藝產(chǎn)生、且人們詳細測定毒理學(xué)數(shù)據(jù)的情況下不夠經(jīng)濟的雜質(zhì)，ICH M7指導(dǎo)原則使用一套輔助性工具預(yù)測相關(guān)結(jié)構(gòu)的安全性、控制相關(guān)雜質(zhì)的可接受限度。輔助工具包含：警示結(jié)構(gòu)（Structural alert）、定量構(gòu)效關(guān)系（Quantitative structure-activity relationship，QSAR）軟件預(yù)測警示結(jié)構(gòu)、細菌致突變試驗、毒理學(xué)關(guān)注閾值（Threshold of Toxicology Concern，TTC）等。

警示結(jié)構(gòu)。人們在對于化學(xué)物質(zhì)與人體遺傳物質(zhì)的反應(yīng)性的研究過程中，總結(jié)出了一些官能團有較大的概率與基因毒性相聯(lián)系，相應(yīng)的官能團結(jié)構(gòu)便稱為警示結(jié)構(gòu)：人們對相關(guān)的警示結(jié)構(gòu)以數(shù)據(jù)庫的形式進行了匯總，并不斷更新。[11]

QSAR軟件預(yù)測警示結(jié)構(gòu)。QSAR軟件預(yù)測是一種借助分子的理化性質(zhì)參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，以數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)手段定量研究有機小分子與生物大分子相互作用、有機小分子在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄等生理相關(guān)性質(zhì)的方法。[12]QSAR軟件預(yù)測可以系統(tǒng)地預(yù)測化合物是否含有警示結(jié)構(gòu)，ICH M7指導(dǎo)原則推薦“基于專家知識規(guī)則”與“基于統(tǒng)計學(xué)”兩種方法的結(jié)合對化合物進行預(yù)測：若兩種方法判定均無警示結(jié)構(gòu)，則我們認為相應(yīng)化合物無警示結(jié)構(gòu)。

如果一個有機雜質(zhì)經(jīng)歷結(jié)構(gòu)鑒定之后，QSAR軟件預(yù)測無警示結(jié)構(gòu)：我們可以直接預(yù)測該化合物無基因毒性。（ICH M7表1中的第5類雜質(zhì)）。

如果一個有機雜質(zhì)經(jīng)歷結(jié)構(gòu)鑒定之后，QSAR軟件預(yù)測有警示結(jié)構(gòu)；但相應(yīng)警示結(jié)構(gòu)也存在于原料藥或中間體的分子結(jié)構(gòu)內(nèi)；同時，有足夠充分的毒理學(xué)數(shù)據(jù)表明，原料藥或中間體無基因毒性：我們也可以預(yù)測該化合物無基因毒性。（ICH M7表1中的第4類雜質(zhì)）。

如果一個有機雜質(zhì)經(jīng)歷結(jié)構(gòu)鑒定之后，QSAR軟件預(yù)測有警示結(jié)構(gòu)；同時，警示結(jié)構(gòu)不存在于原料藥分子結(jié)構(gòu)內(nèi)：我們將該雜質(zhì)判定為ICH M7表1中的第3類雜質(zhì)。該類雜質(zhì)經(jīng)過細菌致突變試驗，被判斷是否是基因毒性雜質(zhì)。

細菌致突變試驗。[13]細菌致突變試驗是一種快速檢驗化合物是否有致DNA突變的試驗。通過此試驗，人們得知相關(guān)化合物是否有對于細菌的基因毒性：第3類雜質(zhì)在獲得相關(guān)信息補充后，可以被歸為第5類雜質(zhì)（Ames試驗陰性）或第2類雜質(zhì)（Ames試驗陽性）。

上述流程已經(jīng)介紹了基因毒性雜質(zhì)相關(guān)的5類雜質(zhì)（ICH M7表1）之中的2～5類。剩下的第1類雜質(zhì)即為4.1節(jié)中提到的、有充分毒理學(xué)研究結(jié)果證明的基因毒性雜質(zhì)，應(yīng)按照相應(yīng)的PDE推知其可接受限度。這樣，5類基因毒性雜質(zhì)相關(guān)的雜質(zhì)類型之中，我們只剩下第2類雜質(zhì)進行可接受限度的設(shè)定了。

毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）。TTC定義了未經(jīng)研究的化學(xué)物質(zhì)在致癌或其他毒性作用風(fēng)險可忽略時的可接受攝入量。確定TTC的方法總體上可認為是非常保守的，它是將50%腫瘤發(fā)生率（TD50）的劑量簡單線性外推到百萬分之一發(fā)生率而得，且采用的TD50數(shù)據(jù)取自最敏感物種和對誘導(dǎo)最敏感的腫瘤發(fā)生部位產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。[14]ICH對于各種服藥周期的藥物的TTC，進行了明確的定量限制（ICH M7表2）。第2類雜質(zhì)即可按照ICH M7表2的約束條件進行可接受限度設(shè)定。

如上即為以輔助性預(yù)測方式，對基因毒性雜質(zhì)進行控制的總體策略。

[1]?ICH指導(dǎo)原則可以在國家藥監(jiān)局藥品審評中心官網(wǎng)上下載：https://www.cde.org.cn/ichWeb/guideIch/toGuideIch/0/1

[2]?ICH Q3A第2節(jié)

[3]?具體方法參見ICH Q1相關(guān)內(nèi)容

[4]?ICH Q3A第6節(jié)

[5]?ICH Q3A第5節(jié)、第7節(jié)

[6]?安全性研究的主體為毒理學(xué)數(shù)據(jù)，通過毒理學(xué)數(shù)據(jù)可以得出在本文第2節(jié)（Q3C）描述的每日允許暴露量的信息，從而判定超過界定限雜質(zhì)的安全限度。

[7]?ICH Q3D第5.2節(jié)

[8]?ICH Q3D第4節(jié)

[9]?百度百科：華海藥業(yè)降壓藥事件

[10]?https://www.ema.europa.eu/en/documents/referral/nitrosamines-emea-h-a53-1490-assessment-report_en.pdf

[11]?https://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/JRC52274/eur_23844_en.pdf

[12]?維基百科：定量構(gòu)效關(guān)系

[13]?維基百科：Ames test

[14]?ICH M7第3節(jié)–總則