免疫熒光原理及應用

免疫熒光（Immunofluorescence，IF）是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一種強大的技術，主要原理是利用熒光標記的抗體作為探針對組織或細胞內特定抗原進行定位和定性分析。
由于其具有特異性強、敏感性高、速度快等優(yōu)點，廣泛用于科學研究（如測定內分泌激素、蛋白質、多肽、核酸、神經遞質、受體、細胞因子、細胞表面抗原、腫瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質）。
隨著多重免疫熒光技術的興起和發(fā)展，在臨床診斷上的應用也越來越豐富（根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內分泌、腫瘤、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等）。

圖1：免疫熒光技術實驗原理（間接法）。圖片來源J Invest Dermatol. 2013 Jan;133(1):e4.

圖2：Confocal 檢測U2OS細胞 KRR1 (A4487，KRR1 Rabbit pAb)，β-Actin (AC004: β-actin Mouse mAb)，DAPI 染核。

圖3：多重免疫熒光檢測乳腺癌組織ER，PR及HER2蛋白表達水平。圖片來源：Daniel M Spagnolo, 2016,J Pathol Inform.

上面的案例展示結果顯示，通過熒光基團單標或多標，輕松實現(xiàn)蛋白亞細胞定位和豐度可視化分析，文章立馬增色不少。

雖然這項技術并不復雜，但很多新手在著手實驗時會遇到各種各樣的問題，從而不能得到理想的實驗結果。ABclonal在長期的實驗中有一些經驗積累，希望對大家有所幫助。

IF實驗流程概覽及關鍵點

圖4：免疫熒光步驟包括細胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等

?IF操作步驟

樣本前處理-細胞樣本

1.洗滌：棄去培養(yǎng)基，在細胞上緩慢加入常溫TBS，清洗2次，每次5秒；

2.固定：在細胞上覆蓋 4%中性甲醛固定液（TBS緩沖液配制），置于4℃，固定15min；固定液需足量；

3.洗滌：去除固定液，使用4℃預冷的TBS緩沖液，漂洗3次，每次5分鐘。

?Tips

◆需避免實驗操作時溫差過大或溫度驟變；固定液需保證足量，可過量使用；

◆甲醛有毒性，加固定液和固定后的清洗需在通風櫥內操作。

樣本前處理-石蠟切片樣本

1.烤片：將石蠟切片按同一朝向放置在切片架上，將其放入55℃的恒溫箱中烤片30分鐘；同時將脫蠟液1缸一起放入55℃的恒溫箱中；

2.脫蠟至水：將石蠟切片連同切片架一起放入脫蠟液1缸中,再一起從恒溫箱中取出置于常溫，5分鐘后，將切片取出浸入到常溫脫蠟液2缸中，并按照脫蠟液2、脫蠟液3、無水乙醇1、無水乙醇2、無水乙醇3也可以選擇梯度濃度乙醇的順序依次將石蠟切片放入缸中，每缸5分鐘；用流水清洗切片5分鐘；

3.抗原修復：在高壓鍋中，加入抗原修復液，高火預熱；待修復液沸騰后將切片置于其中，并完全浸泡組織，蓋好鍋蓋，扣上壓力閥，高火繼續(xù)加熱；待限壓閥開始轉動噴氣后調至中火，同時開始計時2分鐘；計時結束后離開熱源，自然降壓后將高壓鍋移入冷水中緩慢冷卻。待修復液溫度降至室溫后，用緩沖液PBS洗滌3次，每次1min。

?Tips

◆流水清洗時水流不能直接對著切片；

◆操作過程中需一直保持切片處于濕潤狀態(tài)；

◆修復液需完全浸沒切片上組織；

◆修復過程中嚴禁打開儀器或中斷運行程序；

◆修復完成后避免快速冷卻；

◆修復液可根據(jù)實驗需求自行選用修復液

樣本前處理-冰凍切片樣本

1.樣本在OCT包埋液中進行速凍（OCT的配方針對Optimal Cutting Temperature進行了優(yōu)化）；

2.冰凍塊固定在組織卡盤（chuck）中，并固定在切片組件上；

3.切片厚度為10-20μm，逐片收集；

4.擦去多余的OCT，用組化筆勾畫組織的疏水邊界。

?Tips

◆ 切片晾干10-15min，以防止切片在后續(xù)洗滌步驟中脫片。

?染色步驟

1.封閉：用5%空白山羊血清將樣本完全覆蓋，切片需放置于濕盒內，細胞孔板可直接將孔板密封好，置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱孵育30min；

2.一抗稀釋：按照說明書要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；

3.一抗孵育：吸走封閉液，加入稀釋后的一抗，4℃孵育過夜；

4.復溫：將樣本置于常溫，復溫15min

5.洗滌：去除抗體工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；

6.二抗稀釋：按照說明書要求，將抗體稀釋于抗體稀釋液中；

7.二抗孵育：避光室溫1h；

8.洗滌：去除二抗工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；

9.染核/封片：在樣本上滴加DAPI工作液，避光，室溫，孵育10分鐘；去除DAPI工作液，用緩沖液TBST洗滌1次，5分鐘；用緩沖液TBS洗滌3次，每次5分鐘；加入抗熒光衰減封片劑后，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

?Tips

◆ 封閉劑選擇和二抗種屬來源相同的血清，如果是直標一抗選擇和一抗種屬來源相同；

◆ 封閉時間不易過長，30-60min即可，且封閉后不用洗滌，直接加一抗孵育即可；

◆ 一抗孵育4℃過夜比較好，抗原抗體結合會比較充分；

◆ 選擇高質量能滿足免疫熒光應用和物種要求的一抗和熒光二抗，一抗二抗的稀釋比例可以根據(jù)抗體說明書來，再結合自己具體的實驗要求進行優(yōu)化；

◆ 如果涉及到雙標染色，切記要將兩種蛋白的抗體來源種屬區(qū)分開，二抗的熒光素也要區(qū)分開；

◆ 在洗滌過程中，一要注意動作輕柔，固定后的細胞比較脆弱，如果太過劇烈，很容易把細胞吹洗掉，二是洗滌時間要把握好，每次洗滌5min左右，三是切忌不要干片，防止背景過高；

◆ 細胞免疫熒光最好不封片，新手很容易在最后一步功虧一簣

IF常見問題及解決方案

?常見問題-對照實驗的設計

實驗前需要對待檢測蛋白信息進行查詢，以便于了解靶點蛋白表達情況（是否特異性表達，是否需要條件刺激，表達豐度如何以及亞細胞定位）。

加入合適的對照是非常重要的，它可以幫助確認樣品之間的唯一變化是否在實驗變量范圍內，以及包括抗體在內的試劑是否如預期一樣起作用。實驗對照包括藥物學處理、添加胞外配體來調控信號轉導通路，或比較基因表達（Knock-out、siRNA等）不同的細胞。

ABclonal提供Knock-out細胞系及Knock-out細胞裂解液可用作陰性對照及抗體特異性驗證。實驗對照的設計和引入，有利于出現(xiàn)問題時方便進行原因排查，同時也會使實驗結果更加嚴謹及更有說服力。

圖5：通常實驗中會加設陰性試劑對照和陽性樣本對照。

?常見問題-細胞密度

細胞密度是整個實驗是否能成功的關鍵點之一。無論是貼壁細胞還是懸浮細胞，爬片后細胞密度直接影響到后續(xù)的熒光拍照效果。鏡下細胞太多反而會讓圖像效果很亂，沒有針對性；如果細胞數(shù)量太多，產生疊加，也會影響整體熒光效果。

所以一定要根據(jù)細胞的生長速率，保證玻片上的細胞以單細胞層生長，細胞密度以達到75%-85%最佳。

圖6：細胞密度與染色效果的影響。

?常見問題-熒光信號弱

?常見問題-背景高

?常見問題-非特異性染色

ABclonal免疫熒光研究工具

?細胞器及亞細胞結構標志物抗體list（節(jié)選）

圖7：細胞亞顯微結構示意圖附常見細胞器/亞細胞結構標志物抗體