Cas13是可以特異性靶向單鏈RNA的一種CRISPR系統(tǒng)，基于該技術(shù)開發(fā)了線性RNA中特異性敲低和基于核酸酶結(jié)構(gòu)域缺失突變的dCas13的RNA研究。circRNA也屬于單鏈RNA分子，理論上也可以基于Cas13開發(fā)敲低和其他技術(shù)體系。

環(huán)狀RNA（CircRNA）是由前體mRNA外顯子的反向剪接產(chǎn)生的共價封閉的單鏈RNA，最近已成為基因表達(dá)調(diào)控中的一類重要分子。除了反向剪接連接（BSJ）位點(diǎn)外，環(huán)狀RNA與其同源線性mRNA共享重疊序列。這一特征使得很難區(qū)分環(huán)狀RNA及其同源mRNA的功能。

? //??

2020年12月7日，中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心陳玲玲教授，李勁松教授和中科院-馬普學(xué)會計算生物學(xué)研究所楊力教授共同通訊在Nature Methods發(fā)表了一篇circRNA的干擾技術(shù)文章，報道利用gRNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas13（RfxCas13d）靶向系統(tǒng)進(jìn)行circRNA的特異性敲低，并且通過構(gòu)建高通量Cas13文庫進(jìn)行功能性circRNA的篩選[1]。

2022年7月13號，中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心陳玲玲教授在Nature Protocols發(fā)表文章Screening circular RNAs with functional potential using the RfxCas13d/BSJ-gRNA system，作者在先前開創(chuàng)性研究的基礎(chǔ)上，探討可編程RNA引導(dǎo)的RNA靶向CRISPR–Cas13（RfxCas13d）系統(tǒng)通過使用BSJ位點(diǎn)上的導(dǎo)向RNA（gRNAs）靶向序列，有效且特異地區(qū)分環(huán)狀RNA和mRNAs，開發(fā)并探索了Cas13特異性敲低circRNA的條件。本文描述了基于RfxCas13d/BSJ gRNA系統(tǒng)的詳細(xì)方案，用于在人類細(xì)胞系中進(jìn)行大規(guī)模功能性circRNA篩選。

RfxCas13d敲低環(huán)狀RNA的優(yōu)勢

1.短發(fā)夾狀RNA（shRNA）或小干擾RNA 靶向環(huán)狀RNA的BSJ位點(diǎn)已用于篩選功能性環(huán)狀RNA。雖然這兩種方法都很容易實現(xiàn)，但shRNA或小干擾RNA與線性mRNA的部分互補(bǔ)性（接口處至少50%序列）有可能影響同源線性mRNA表達(dá)；

2. 通過CRISPR–Cas9進(jìn)行基因組編輯也被用于通過去除形成外顯子的整個環(huán)狀RNA或破壞環(huán)狀RNA生產(chǎn)的內(nèi)含子互補(bǔ)順式作用元件來敲低環(huán)狀RNA，但這種方法很復(fù)雜，因為順式元件的復(fù)雜性也可能影響同源線性mRNA；

RNA靶向VI型CRISPR系統(tǒng)（Cas13a、Cas13b和Cas13d），可直接切割哺乳動物細(xì)胞中的單鏈RNA。Cas13通過適當(dāng)?shù)囊龑?dǎo)RNA（gRNAs）被招募到特定的RNA序列，其可以與靶向RNA 形成堿基對。RfxCas13d是circRNA干擾的最佳系統(tǒng)，通過使用跨越BSJ位點(diǎn)的gRNAs靶向序列（BSJ gRNAs），具有最高的干擾效率，并且對其同源mRNA沒有可檢測的影響。與shRNA及siRNA介導(dǎo)的circRNA敲除相比，RfxCas13d BSJ gRNA系統(tǒng)顯示circRNA干擾的更高效率，并具有更高的目標(biāo)序列保守性，更加依賴非錯配的序列配對結(jié)合（高特異性，圖1）。

gRNA文庫設(shè)計和篩選流程

CircRNA由前體mRNAs的反向剪接產(chǎn)生，與同源mRNAs（BSJ位點(diǎn)除外）具有重疊序列。BSJ gRNAs旨在靶向跨越BSJ位點(diǎn)的序列，以區(qū)分庫中的環(huán)狀RNA和mRNAs。除了BSJ gRNA本身之外，每個circRNA還需要一個配對的對照gRNA，其一半序列被置亂序列（例如，匹配的15個核苷酸+隨機(jī)的15個核苷酸）替換為陰性對照。

?gRNA庫包含多個BSJ gRNA（BSJ序列任一側(cè)互補(bǔ)序列15 nt+15 nt、10 nt+20 nt、20 nt+10 nt、14 nt+14 nt和13 nt+13 nt）和每個靶向circRNA的一對對照gRNA；

?將gRNA質(zhì)粒文庫包裝到慢病毒中，并用于感染穩(wěn)定表達(dá)RfxCas13d蛋白的相關(guān)細(xì)胞，以進(jìn)行功能篩選；

?30天后，收獲細(xì)胞，分離其基因組DNA以擴(kuò)增gRNA文庫；

?篩選分析gRNA分布和識別候選circRNA；

? 檢測干擾后細(xì)胞的功能改變；

注：文庫構(gòu)建應(yīng)當(dāng)限制PCR周期（18個以內(nèi)），避免擴(kuò)增寡核苷酸文庫；最小化細(xì)胞生長持續(xù)時間，避免文庫轉(zhuǎn)化后細(xì)胞克隆產(chǎn)生的影響。同時，作者建立Cas13d mediated circRNA screen（CDCscreen）的分選方法，對screen結(jié)果進(jìn)行分選和分析。

? //??

本文在已有RfxCas13d/BSJ gRNA方法學(xué)的基礎(chǔ)上，設(shè)計高通量gRNA文庫，方便對circRNA開展研究。該方案包括gRNA文庫的設(shè)計、構(gòu)建和轉(zhuǎn)導(dǎo)、篩選結(jié)果分析和功能性circRNA候選的驗證，3-4個月即可完成工作。該方案可應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)和體內(nèi)，以在未受干擾的條件下或在環(huán)境刺激下識別影響細(xì)胞生長的高表達(dá)環(huán)狀RNA，而不會干擾其同源線性mRNAs。作者在文末附上了完整的實驗方案和流程，并提示了相關(guān)的注意細(xì)節(jié)，對circRNA研究具有重要的參考價值。

原文鏈接

https://doi.org/10.1038/s41596-022-00715-5

參考文獻(xiàn)

[1]. Li, S., Li, X., Xue, W. et al. Screening for functional circular RNAs using the CRISPR–Cas13 system. Nat Methods (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-01011-4

轉(zhuǎn)載請聯(lián)系郵箱授權(quán)：circRNA@163.com