葉綠體普遍存在于植物體中，葉綠體基因組是一個典型的雙鏈環(huán)狀DNA分子，一個植物當(dāng)中含有多個葉綠體，一個葉綠體中含有12個cpDNA分子。 常見的植物葉綠體基因組大小一般在150-160 kb左右，藻類會略小一些，在80-100 kb左右，一般由四部分組成，包括一個LSC和一個SSC，以及二者之間的兩個IR區(qū)。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，利用葉綠體來研究細(xì)胞器的起源、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化正受到越來越廣泛的關(guān)注。

圖1 具有代表性的金腰屬葉綠體基因組圖譜

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凌恩生物負(fù)責(zé)對每一個樣本的葉綠體DNA（cpDNA）進(jìn)行富集及抽提，有自主研發(fā)的細(xì)胞器提取技術(shù)，提取經(jīng)驗豐富。有專業(yè)團(tuán)隊負(fù)責(zé)跟進(jìn)每一個項目，從細(xì)胞器DNA制備、Hiseq建庫及測序、后續(xù)生物信息分析，直至為客戶提供滿意的結(jié)果。 本期主要介紹葉綠體基因組的一些高級分析內(nèi)容。

1、共線性分析

共線性是指遺傳學(xué)中的基因連鎖關(guān)系，是不同物種染色體上同源基因以相同順序排列的現(xiàn)象。兩個物種之間的共線性程度可以作為衡量他們之間進(jìn)化距離的尺度，可以知道物種間的親緣關(guān)系。對基因組間的局部共線性塊進(jìn)行相似度、重排、倒置等現(xiàn)象的分析可以來闡述物種演化中發(fā)生的事件。

圖2 葉綠體基因組mVista共線性分析

2、系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogenetic tree）又稱為系統(tǒng)進(jìn)化樹，是用一種類似樹狀分支的圖形來概括各物種之間的親緣關(guān)系，可用來描述物種之間的進(jìn)化關(guān)系。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可以找出不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，理解祖先序列與其后代之間的關(guān)系，同時也可以估算一組共有共同祖先的物種間的分歧時間。 細(xì)胞器基因組非常保守，常用來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹來研究動植物的物種分類和進(jìn)化地位。凌恩生物構(gòu)建細(xì)胞器系統(tǒng)發(fā)生樹的方法有以下兩種： （1）基于樣品與參考基因組的群體SNP矩陣構(gòu)建進(jìn)化樹：對于每一個樣本，按照相同順序?qū)⑺蠸NP相連，獲得相同長度的fasta格式的序列（其中一個為參考序列），作為輸入文件用于進(jìn)化樹構(gòu)建。 （2）基于Core基因構(gòu)建進(jìn)化樹：對細(xì)胞器基因組鑒定出來的單拷貝Core基因，利用MUSCLE v3.8.31軟件進(jìn)行蛋白多序列的比對，比對結(jié)果用于進(jìn)化樹構(gòu)建。

圖3 基于cpPCGs+nrDNA矩陣的金腰屬系統(tǒng)發(fā)育樹

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3、選擇壓力分析

選擇壓力是指外界施加給某物種生物進(jìn)化過程中的壓力，使得物種適應(yīng)自然環(huán)境。在遺傳學(xué)中，ω= Ka/Ks或者dN/dS表示的是非同義突變（Ka）和同義突變（Ks）之間的比率。一般認(rèn)為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。通常認(rèn)為，ω > 1表明有正選擇（Positive Selection）效應(yīng)，即有些有利突變正受到選擇；ω = 1不受選擇，即中性進(jìn)化（Neutral Evolution）；如果0 < ω < 1，則認(rèn)為有純化選擇（Negative or Purifying Selection）作用，ω值越小，說明受到的負(fù)選擇壓越大，氨基酸序列越保守。

圖4 金腰屬的選擇壓力分析

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4、葉綠體基因組的IR區(qū)擴(kuò)張與收縮

葉綠體基因組IR區(qū)指的是葉綠體基因組中2個反向重復(fù)區(qū)域（IRs）。葉綠體基因組的IR區(qū)域被認(rèn)為是最保守的區(qū)域，但其邊界區(qū)序列可能會向外延伸擴(kuò)張，也可能向內(nèi)部收縮，從而導(dǎo)致相關(guān)基因拷貝數(shù)的變化，或者導(dǎo)致邊界區(qū)域假基因的產(chǎn)生，這是葉綠體基因組進(jìn)化中的共有現(xiàn)象，也是其長度變異的主因。 通過IR區(qū)的擴(kuò)張與收縮研究，可以獲悉導(dǎo)致相關(guān)基因拷貝數(shù)的變化，或者導(dǎo)致邊界區(qū)域假基因的產(chǎn)生，以此來描述造成不同譜系間葉綠體基因組大小差異的原因。

圖5 IR區(qū)的擴(kuò)張與收縮

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5、結(jié)構(gòu)變異檢測

細(xì)胞器基因組進(jìn)行結(jié)構(gòu)變異檢測主要有三種：SNP、InDel和SV。與參考基因組比對，分析近源物種細(xì)胞器基因組之間的變異情況，能夠更好的對個體或群體進(jìn)行差異性分析。 SNP（單核苷酸多態(tài)性）是指由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在編碼基因內(nèi)，也有可能在非編碼序列上，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（coding SNP，cSNP）因其可能影響個體的功能而備受關(guān)注。 InDel是DNA序列的插入（Insertion）和缺失（Deletion）現(xiàn)象的總稱，狹義的InDel表示1~10bp的短InDel。在基因組編碼區(qū)域，InDel的發(fā)生可能會引起移碼突變、氨基酸改變、假基因的出現(xiàn)等等現(xiàn)象。這里分析的是狹義的InDel。 基因組結(jié)構(gòu)變異（SV，Structural Variation）通常是指基因組內(nèi)DNA片段缺失、插入、重復(fù)、倒位、異位。使用MUMmer軟件對目標(biāo)基因組和參考基因組進(jìn)行比對，再使用LASTZ對區(qū)域間進(jìn)行比對，從區(qū)域比對結(jié)果中查找SV。

圖6 全基因組結(jié)構(gòu)變異類型配對圖

6、核苷酸多態(tài)性（Pi）分析

核苷酸多態(tài)性（Pi）是衡量特定群體多態(tài)性高低的參數(shù)，是指在同一群體中隨機(jī)挑選的兩條DNA序列在各個核首酸位點上核昔酸差異的均值。核苷酸多態(tài)性（Pi）能揭示不同物種核酸序列的變異大小，變異度較高的區(qū)域可以為種群遺傳學(xué)提供潛在的分子標(biāo)記。例：基因和基因間區(qū)的核苷酸多樣性分析。

圖7 44個金腰屬物種cp基因組的核苷酸多樣性（Pi）分析

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7、共有基因和特有基因分析

所有樣本中都存在的同源基因稱為“共有基因”（core gene），去掉共有基因后得到的為非共有基因（Dispensable gene），特有基因（specific gene）為只有該樣本特異擁有的基因。共有基因和特有基因很有可能與樣品的共性和特性相對應(yīng)，可以作為樣本間功能差異的研究依據(jù)。

圖8 Core-Pan基因稀釋曲線

圖9 基因組的共有/特有基因數(shù)

8、密碼子偏好性分析

某一特定密碼子在編碼對應(yīng)氨基酸的同義密碼子中的相對概率，可以反應(yīng)密碼子的偏好性程度。通過計算Relative synonymous codon usage（RSCU）獲得密碼子的偏好性值。研究密碼子的使用模式，對于探明物種進(jìn)化壓力以及進(jìn)一步的遺傳研究都有重要的意義。

圖10 烏頭屬物種密碼子偏好性分析

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9、簡單重復(fù)序列SSR分析

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat, SSR）又稱作微衛(wèi)星序列（microsatellite, MS），是一類由1-6個核苷酸為基本單位多次重復(fù)而形成的DNA片段。SSR數(shù)量豐富、多態(tài)性高、均勻覆蓋整個基因組、呈共顯性遺傳且檢測簡單，因此被作為第二代分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位、遺傳多樣性研究、分子輔助育種、種質(zhì)資源鑒定等領(lǐng)域。

圖11 姜科植物葉綠體基因組的簡單序列重復(fù)序列（SSR）分析

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10、重復(fù)序列分析

重復(fù)序列被認(rèn)為在基因組重組和重排中起重要作用，并且在某些群體中也包含有系統(tǒng)發(fā)育信息。葉綠體基因組的重復(fù)序列包括串聯(lián)和散在重復(fù)，其中散在重復(fù)又稱為長重復(fù)序列，分為：正向重復(fù)（forward repeat）、反向重復(fù)（reverse repeat）、回文重復(fù)（palindromic repeat）和互補(bǔ)重復(fù)（complement repeat）四種類型。

圖12 長重復(fù)序列分類圖

參考文獻(xiàn)

[1]?A Comprehensive Analysis of Chloroplast Genome Provides?New Insights into the Evolution of the Genus Chrysosplenium. International Journal of Molecular Sciences, 2023. [2]?Complete chloroplast genomes provide insights into?evolution and?phylogeny of?Zingiber?(Zingiberaceae). BMC Genomics, 2023. [3] Comparative Analysis of the Chloroplast Genome for Aconitum Species: Genome Structure and Phylogenetic Relationships.?Frontiers in Genetics, 2022.