測序級?II，純化胰蛋白酶背景參考：

牛胰腺表達(dá)兩種形式的胰蛋白酶，主要的陽離子型和次要的陰離子型。這些蛋白質(zhì)序列具有72%的同一性，而它們的編碼區(qū)具有78%的同一。

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這些蛋白質(zhì)中的每一種都被進(jìn)一步加工成不同的形式。催化胰蛋白酶包含一個靈活的“自溶回路”（殘基G145-V157）（Schroeder和Shaw 1968，以及Bartunik等人1989），在該回路中的K148-S149處的顯性單鏈形式B胰蛋白酶的自溶導(dǎo)致a胰蛋白酶的形成。K193-D194處的進(jìn)一步自溶導(dǎo)致Psi胰蛋白酶的形成（Fehlhammer和Bode 1975）。

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陽離子和陰離子胰蛋白酶蛋白均表達(dá)為胰蛋白酶原原酶，具有15個殘基的信號肽（M1-A15）和8個殘基前肽（F16-K23）。所有已知胰蛋白酶的三維折疊高度保守。此外，催化三聯(lián)體和催化三聯(lián)體側(cè)翼區(qū)域高度保守（Hartley 1970）。

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艾美捷測序級?II，純化胰蛋白酶特異性：

胰蛋白酶在賴氨酸和精氨酸氨基酸殘基的C端側(cè)切割肽。如果脯氨酸殘基位于切割位點(diǎn)的羧基側(cè)，則不會發(fā)生切割。如果酸性殘基位于裂解位點(diǎn)的任一側(cè)，則水解速率已顯示較慢。

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艾美捷測序級?II，純化胰蛋白酶化驗(yàn)方法：

文獻(xiàn)中描述了各種測定。Spencer等人（1975）報道了一種使用完整蛋白作為底物的測定，該蛋白上附著有熒光染料1-苯胺-8-萘磺酸鹽（ANS）。Stewart（1973）描述了一種使用顯色底物N-苯甲?；鵇L-精氨酸對硝基苯胺（DL-BAPA）、N-戊?；?L-苯基對硝基苯胺的方法。Ford等人（1973）報告了使用對硝基-苯基對胍苯甲酸酯（NPGB）測定固定化胰蛋白酶的活性位點(diǎn)暴露，形成了穩(wěn)定的酰化酶，加上在410nm處測定的對硝基苯酚分光光度法。沃辛頓實(shí)驗(yàn)室使用的測定方法如下所述。

在25°C、pH 8.2、0.01 M鈣離子存在下，一個單元每分鐘水解1μmol對甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯（TAME）。

試劑：

0.046百萬特里斯?HCl緩沖液，pH 8.1，含0.0115 M氯化鈣

0.01 M TAME（對甲苯磺?；?L-精氨酸甲酯）

0.001 N鹽酸

酶：

在0.001 N HCl中稀釋至10-20 ug/ml的濃度。

程序：

將分光光度計設(shè)置在247 nm和25°C。

按如下方式將移液管移到每個試管中：

0.046百萬特里斯?HCl緩沖液，pH 8.1 2.6 ml

0.01 M TAME 0.3 ml

在25°C的分光光度計中培養(yǎng)3-4分鐘，以達(dá)到溫度平衡，并建立空白率（如有）。加入0.1 ml稀釋酶，記錄A247 3-4分鐘。從曲線的初始線性部分確定ΔA247。反應(yīng)保持線性，A247約為0.320。反應(yīng)應(yīng)線性至少三分鐘。如果不是這樣，重復(fù)使用更少的酶。