腫瘤壞死因子α（TNF-α）與TNF-α受體（TNFR）相互作用在各種自身免疫性疾病，特別是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制中起著核心作用，因此被認為是藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵靶點。然而，能夠特異性阻斷TNF -α-TNFR相互作用的天然化合物鮮有報道。（-）-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（EGCG）是綠茶中最活躍、最豐富、研究最深入的多酚化合物。然而，EGCG改善自身免疫性關(guān)節(jié)炎的分子機制仍有待闡明。

AbMole（https://www.abmole.cn/）精研抑制劑十年，最新的科研動態(tài)不斷與您分享。本期與您分享的是:靶向TNF-α-TNFR與EGCG相互作用阻斷人滑膜成纖維細胞NF-κB信號傳導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可直接與TNF-α、TNFR1、TNFR2以相似的μM親和力結(jié)合，破壞TNF-α與TNFR1、TNFR2的相互作用，抑制TNF-α誘導(dǎo)的L929細胞死亡，阻斷293-TNF-α應(yīng)答細胞系中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化，最終抑制HFLS和MH7A細胞中TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路。因此，經(jīng)常飲用綠茶中的EGCG可能代表了治療TNF-α-相關(guān)疾病的潛在治療劑。

MTT（Abmole，M7007，純度>99%）

（https://www.abmole.cn/products/mtt.html）是一種用于測定細胞增殖的試劑。

Lipopolysaccharides（Abmole，M9524）

（https://www.abmole.cn/products/lipopolysaccharides.html）脂多糖是從革蘭氏陰性菌外膜的外葉中提取的內(nèi)毒素，效價大于等于500000 EU/mg。本品來源于大腸桿菌 O55:B5。

Actinomycin D（Abmole，M4881，純度>99%）

（https://www.abmole.cn/products/actinomycin-d.html）是一種從土壤細菌中分離出來的多肽抗生素。

EGCG的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。纖維母細胞瘤細胞系L929對TNF-α-介導(dǎo)的細胞死亡（壞死下垂）高度敏感，它經(jīng)常被用作篩選抑制TNF-α功能的天然小分子的標(biāo)準(zhǔn)模型。為了研究EGCG對L929細胞活力的影響，我們首先用濃度為1.25、2.5和5 μM的EGCG處理L929細胞24小時后進行MTT實驗。與未處理的對照組相比，EGCG在L929細胞中濃度高達5 μM時沒有明顯的細胞毒性作用（圖1B）。因此，后續(xù)細胞實驗中使用的EGCG濃度不超過5 μM。接下來，為了確定EGCG是否能抑制TNF-α-誘導(dǎo)的L929細胞死亡，在ACT-D （1 μg/mL）存在下，分別用TNF-α （10 ng/mL）或TNF-α加EGCG（0.31、0.62、1.25、2.5或5μM）處理10 h后進行MTT實驗。如圖1C所示，TNF-α刺激顯著抑制L929細胞的活力，而EGCG處理可濃度依賴性地改善TNF-α刺激引起的細胞活力下降。

與此一致的是，我們直觀地觀察到，TNF-α和ACT-D處理10小時后，L929細胞表現(xiàn)出收縮、分離和死亡，EGCG處理可以顯著且濃度依賴地改善這種情況（圖1D和E）。通過Annexin V-FITC /PI染色和流式細胞術(shù)分析，我們進一步證實了EGCG對TNF-α誘導(dǎo)的L929細胞壞死的抑制作用（圖1F）。TNF-α和ACT-D處理6小時后，L929細胞的壞死率顯著升高，而EGCG則顯著且濃度依賴地降低了壞死率（圖1G）。這些結(jié)果有力地證明了EGCG能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的L929細胞死亡。

HFLS和MH7A細胞在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，是兩種廣泛建立的用于評估天然抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物的細胞模型。為了研究EGCG對HFLS和MH7A細胞活力的影響，在不同濃度EGCG作用24 h后進行MTT實驗。如圖3A和B所示，EGCG在5 μM濃度下對HFLS和MH7A細胞沒有明顯的細胞毒作用。為了進一步闡明EGCG對TNF-α-誘導(dǎo)的NF-κB活化的詳細抑制機制，我們采用western blotting分析了EGCG是否可以抑制TNF-α處理的HFLS和MH7A細胞NF-κB信號通路的早期激活。

正如預(yù)期的那樣，TNF-α（10 ng/mL）處理導(dǎo)致HFLS和MH7A細胞中NF-κB信號通路的明顯激活，通過觀察到IKKα/β，IκBα和p65磷酸化水平的增加以及IκBα的降解來檢測（圖C-E）。有趣的是，這些效應(yīng)在EGCG （5 μM）處理后60分鐘內(nèi)被顯著抑制（圖C-E）。總之，這些結(jié)果表明EGCG抑制TNF-α-刺激的HFLS和MH7A細胞NF-κB信號通路的早期激活。

通過western blotting分析確定EGCG是否可以抑制LPS誘導(dǎo)的HFLS和MH7A細胞的NF-κB活化。如圖4所示，LPS（2μg/mL）對HFLS和MH7A細胞均有明顯的NF-κB活化作用，在60 min內(nèi)觀察到p65磷酸化水平升高。有趣的是，EGCG（5 μM）處理對HFLS和MH7A細胞中LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化沒有抑制作用。

鳴謝：Huanhuan Xu, et al. Biomed Pharmacother. 2023 May;161:114575.