酒精相關肝病（ALD）是常見的慢性肝病，經(jīng)常導致肝硬化；隨著發(fā)病率上升，已成為肝移植的主要適應癥。ALD從酒精相關脂肪肝開始，到以肝臟炎癥為特征的亞臨床脂肪肝性肝炎，進而出現(xiàn)進行性纖維化，最終導致肝硬化。目前將近75%的ALD患者在發(fā)生失代償期肝硬化后才被診斷，導致錯過了最佳治療階段。肝病的準確診斷依賴活檢，這會導致1%的患者出現(xiàn)嚴重并發(fā)癥。而現(xiàn)有的非侵入性生物標志物在疾病早期準確性有限，嚴重減少了及時發(fā)現(xiàn)和干預疾病的機會。

2022年6月，馬克斯·普朗克生物化學研究所Matthias Mann團隊在Nature medicine（IF 50.768）上發(fā)表題為"Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease“的研究文章，作者利用DIA蛋白質(zhì)組學結(jié)合機器學習算法，成功確定了三組生物標志物，可以檢測顯著纖維化、輕度炎癥活動和任何脂肪變性。換言之，該研究標志物可檢測任何肝損傷，并幫助預測患者是否具有疾病進展風險，有巨大的臨床應用潛力。

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研究材料

ALD篩選隊列（n=459，均有血液樣本，其中79人有肝臟活檢組織）；
健康隊列（n=137，均有血液樣本）；
獨立ALD驗證隊列（n=63，均有血液樣本）

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技術(shù)路線

步驟1：患者入組及基線信息分析；步驟2：?蛋白組學：分析肝臟病變對肝臟和血漿蛋白質(zhì)組的影響；步驟3：數(shù)據(jù)分析：肝臟和血漿蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)整合；步驟4：?機器學習：ALD早期病理學生物標志物；步驟5：?獨立隊列驗證模型性能。

研究結(jié)果

1. 患者入組及基線信息分析

本研究人群來自三個隊列的參與者：1）腸肝軸-ALD隊列（GALA-ALD），n=459，具有隨訪數(shù)據(jù)的前瞻性隊列（連續(xù)招募的具有有害飲酒史的患者，代表疾病早期的無癥狀ALD）；2）腸肝軸-健康參與者（GALA-HP），n=137。與GALA-ALD相匹配的橫斷面隊列；3）獨立ALD驗證隊列，n=63，來自ALD篩查研究的橫斷面隊列。作者進一步統(tǒng)計了所有受試者的臨床特征。

表1?參與者基線特征

2. 蛋白組學：分析肝臟病變對肝臟和血漿蛋白質(zhì)組的影響

肝臟蛋白質(zhì)組檢測出717種獨特差異蛋白（占總量化蛋白的13%）。其中658種蛋白在纖維化階段，135種蛋白在炎癥活動階段，68種蛋白在脂肪變性階段發(fā)生顯著失調(diào)。纖維化對肝臟蛋白質(zhì)組的影響最大、其次是炎癥；而炎癥過程中失調(diào)的所有蛋白質(zhì)中84%在纖維化中失調(diào)。根據(jù)人類蛋白質(zhì)圖譜的注釋對失調(diào)蛋白進行分組，發(fā)現(xiàn)隨著纖維化的增加，87%注釋為肝臟特異性的蛋白在肝組織中下調(diào)；相反，80%注釋為分泌的蛋白質(zhì)被上調(diào)。在纖維化階段最相關的前20種蛋白中，主要是肝臟分泌的蛋白（如TGFBI 和 EMILIN1），纖維化相關蛋白（如IGFBP7和 TNXB）。此外，前20種驗證相關蛋白中約50%是細胞骨架蛋白，指征了炎癥過程中肝臟細胞結(jié)構(gòu)變化。而脂滴蛋白PLIN2和脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）可作為NAFLD47患者從單純脂肪變性變向非酒精性脂肪肝炎的預測標志物，與肝脂肪變性相關的系數(shù)分別排在第1和第16位。

?血漿蛋白質(zhì)組檢測發(fā)現(xiàn)，共225種蛋白在纖維化階段（206種）、炎癥活動（163種）和脂肪變性（48種）的組織學階段發(fā)生顯著變化。其中，隨著纖維化階段增加，134中蛋白上調(diào)、91中下調(diào)。在注釋為肝臟特異性或分泌的失調(diào)蛋白中，分別發(fā)現(xiàn)83%和64%被下調(diào)。下調(diào)的簇包含參與補體系統(tǒng)蛋白、凝血級聯(lián)反應相關蛋白、載體蛋白和和載體蛋白。相關性分析顯示，分別有106種、55種和5種蛋白與纖維化、炎癥和脂肪變性相關。其中補體成分C7、QSOX1和LGALS3BP與纖維化程度相關性最高（也是前三個與炎癥相關蛋白），具有纖維化和炎癥標志物潛力。

?3.?數(shù)據(jù)分析：肝臟和血漿蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)整合

肝臟和血漿中總共有420種蛋白質(zhì)被量化， 他們在二維空間中的水平表現(xiàn)出雙模態(tài)模式。其中一組蛋白質(zhì)，肝臟和血漿的相對豐度排名在很大程度上是相關的 （“對角聚類”），而另一組沒有相關性（“垂直聚類”）。相關性分析顯示，112種蛋白在肝臟和血漿樣本之間存在顯著關聯(lián)。肝臟和血漿蛋白質(zhì)組的協(xié)方差分析中找到46種共調(diào)控蛋白，功能涉及免疫和炎癥反應、細胞粘附、ECM組織、蛋白酶抑制劑和細胞內(nèi)酶等。

4. 機器學習：ALD早期病理學生物標志物

作者比較了22種機器學習分析方法，并確定邏輯回歸模型作為最終分類器。作者選定三組標志物分別識別顯著纖維化（9種蛋白）、輕度炎癥活動（6種蛋白）和任何程度的肝脂肪變性（6種蛋白）。在包含三組標志物的22個蛋白中，有8種在血漿和肝臟中受到協(xié)同調(diào)節(jié)，包括 C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN 和 SERPINF1。重要的是，這三組標志物對顯著纖維化（AUC=0.90，95% CI=0.899–0.905）、輕度炎癥（AUC=0.85，95% CI 0.851–0.858）和脂肪變性（AUC=0.91，95% CI 0.907– 0.915）均有很好的診斷效能，且優(yōu)于現(xiàn)有的15項臨床測試模型。

5. 獨立隊列驗證模型性能

驗證結(jié)果顯示，在健康對照組（n=136）中，該模型正確排除了顯著纖維化、晚期纖維化和輕度炎癥，其準確率分別是99%、100%和98% ，約15%的個體被歸為脂肪變性陽性，與他們BMI與ALD隊列一致相關。此外，在有酒精濫用史且由于肝硬度低而未進行活檢的患者子集（n=97）中，該模型排除顯著和晚期纖維化的準確率分別是93%和100%。接著，作者在獨立的ALD隊列（n=63）中進行驗證，顯著纖維化和輕度炎癥的模型效能高于其他同類模型，ROC-AUC分別是0.87和0.81。更重要的是，顯著纖維化的蛋白組學模型相比于現(xiàn)有標志物，對患者肝臟相關事件（LRE）具有最高的判別準確率（Harrell's C ?= 0.900 ，3年和5年AUC分別是 0.945和0.933）；對于全因死亡率，蛋白組學模型也表現(xiàn)最好（Harrell's C ?= 0.789、3 年和 5 年 AUC 分別 = 0.836 和 0.818）。

小編小結(jié)

作者結(jié)合了3個隊列（一個前瞻性、一個橫斷面和一個獨立隊列），利用DIA蛋白組學技術(shù)探究肝臟病理生理相關的肝臟和血漿蛋白組學變化，發(fā)現(xiàn)肝臟和血漿蛋白質(zhì)組在ALD期間都經(jīng)歷了廣泛的重塑過程，其中影響最大的是纖維化，其次是炎癥和脂肪變性。接著，作者還利用機器學習定義了用于同時檢測“顯著”纖維化（纖維化階段 ≥F2）、輕度炎癥活動和任何脂肪變性的生物標志物組，并在與現(xiàn)有的測試比較中展現(xiàn)了優(yōu)于或可比同類比較器的性能。重要的是，結(jié)合隨訪數(shù)據(jù)進一步證實了蛋白組學模型對于肝臟相關事件和全因死亡率的高預后性能。本研究為酒精性肝病的臨床精準防治奠定了基礎。