期刊：NATURE GENETIC（IF 41.307 ）

技術(shù)服務(wù)：scRNA-Seq

導(dǎo)語

腫瘤的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性越來越被認(rèn)為是腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療失敗的驅(qū)動因素。單細(xì)胞RNA測序能夠?qū)δ[瘤單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并揭示了同一腫瘤的惡性細(xì)胞之間的異質(zhì)性。針對各種癌癥類型的研究也表明，存在與應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)和缺氧有關(guān)的癌癥細(xì)胞狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境（TME）中特定細(xì)胞類型和癌癥細(xì)胞狀態(tài)之間也存在因果關(guān)系。這些工作促使我們系統(tǒng)地研究TME的腫瘤惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞之間的關(guān)系。

研究內(nèi)容

對15種癌癥類型進(jìn)行了泛癌scRNA-Seq分析，并確定了一系列基因模塊，這些基因模塊的表達(dá)定義了復(fù)發(fā)性癌癥細(xì)胞狀態(tài)，包括“應(yīng)激”、“干擾素反應(yīng)”、“上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化”、“金屬應(yīng)答”、“基底細(xì)胞”和“纖毛細(xì)胞”。空間轉(zhuǎn)錄組分析將癌癥細(xì)胞中的干擾素反應(yīng)與腫瘤微環(huán)境中的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聯(lián)系起來。使用小鼠模型，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)干擾素反應(yīng)模塊的誘導(dǎo)因腫瘤位置而異，并在淋巴細(xì)胞消除后減弱。

研究思路

研究結(jié)果

1. 不同癌癥類型的重復(fù)基因模塊

手術(shù)收集了19例未經(jīng)治療的患者腫瘤，涵蓋9種癌癥類型：卵巢癌（OVCA）、子宮內(nèi)膜癌（UCEC）、乳腺癌（BRCA）、前列腺癌（PRAD）、腎臟癌（KIRC）、肝臟癌（LIHC）、結(jié)腸癌（COAD）和胰腺癌（PDAC），以及胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）。通過marker基因、singleR注釋和inferCNV分析來識別惡性細(xì)胞。還對之前發(fā)表的腫瘤數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，包括：PDAC21、LIHC22、膽管癌（CHCA）、肺腺癌（LUAD）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）膚鱗狀細(xì)胞瘤（SKSC）、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）和少突膠質(zhì)瘤（OGD），共來自62例未經(jīng)治療的原發(fā)腫瘤樣本，15種癌癥類型。

使用非負(fù)矩陣因子分解（NMF）分析惡性細(xì)胞，用基因模塊鑒定為共表達(dá)基因集。檢測樣本中共表達(dá)的基因組，即在細(xì)胞亞群中一致表達(dá)的基因。為了在腫瘤中尋找重復(fù)出現(xiàn)的基因模塊，比較了已鑒定模塊的基因組成。盡管在各種癌癥類型中獨(dú)立鑒定了這些模塊，但我們發(fā)現(xiàn)在不同腫瘤中獲得的模塊有顯著重疊。

分析構(gòu)建了16個(gè)基因模塊，范圍從9到297個(gè)基因。一些模塊在特定的器官系統(tǒng)（如大腦或婦科器官）中富集，而另一些模塊則跨越了幾個(gè)器官系統(tǒng)和組織學(xué)。在輸卵管、乳房和肝臟正常上皮數(shù)據(jù)集中測試了模塊的過度分散，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)模塊存在于正常組織中，但分散度較低，這表明這些模塊并不是針對癌癥的。

由細(xì)胞周期基因（如TOP2A、PCNA）組成的高度重復(fù)性模塊，和應(yīng)激反應(yīng)（如JUN、FOS、HSPA1B），被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的一致特征?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)也支持了癌癥細(xì)胞中存在這種狀態(tài)。

干擾素反應(yīng)模塊被廣泛檢測到，包含干擾素刺激的基因（如STAT1和IFIT1）和抗原呈遞的成分（MHCI和MHCII），這是干擾素的一種特征性作用。雖然MHC II的表達(dá)通常與專業(yè)抗原呈遞細(xì)胞相關(guān)，但該途徑也在正常上皮細(xì)胞和癌癥細(xì)胞中表達(dá)。

還發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與代謝過程相關(guān)的模塊：缺氧模塊（例如VEGF、ADM）和氧化磷酸化模塊（例如ATP5H、LAMTOR2）。金屬硫蛋白基因的另一個(gè)基因模塊（稱之為金屬反應(yīng)模塊）可能在幾種癌癥類型的增殖和耐藥性中發(fā)揮作用。

另一組模塊與細(xì)胞身份對應(yīng)，似乎與起源的組織和細(xì)胞有關(guān)。大多數(shù)腫瘤來源于上皮，因此確定了與已知上皮細(xì)胞類型標(biāo)志物重疊的模塊：肺泡模塊（如AGER、CAV1），特別存在于LUAD中，以及基底細(xì)胞（如KRT5和KRT15）、鱗狀細(xì)胞（如KLK10、LY6D）和腺細(xì)胞（如CLU、MUC5B）模塊。在子宮內(nèi)膜樣OVCA和UCEC、LUAD和GBM中存在由纖毛相關(guān)基因（如FOXJ1、PIFO）組成的模塊。正常輸卵管和肺上皮組織中存在該模塊，表明其在癌癥中的差異表達(dá)反映了起源組織的異質(zhì)性。

跨越多種癌癥類型的兩個(gè)模塊與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）有關(guān)：一個(gè)完整的間充質(zhì)模塊（cEMT）（例如COL1A1、FN1）和一個(gè)缺乏典型間充質(zhì)標(biāo)記物（例如LAMC2、VIM）的部分間充質(zhì)組件（pEMT），例如膠原基因。

最后，確定了三個(gè)與神經(jīng)腫瘤特異性模塊：類星形膠質(zhì)細(xì)胞（AC）（例如APOE、ALDOC）、類少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（OPC）（例如OLIG1、OLIG2）和類神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）（如DLX1、DLX5）模塊。

2. 通過基因模塊表達(dá)定義癌癥細(xì)胞狀態(tài)

為了了解基因模塊是如何在單個(gè)細(xì)胞水平上組裝的，對每個(gè)惡性細(xì)胞的每個(gè)模塊的表達(dá)進(jìn)行評分。對19例不同腫瘤細(xì)胞模塊評分進(jìn)行降維，癌細(xì)胞不按患者或癌癥類型分組，而是按其最高表達(dá)的模塊分組。分析發(fā)現(xiàn)某些模塊之間的一些共表達(dá)：例如pEMT與應(yīng)激和干擾素反應(yīng)共表達(dá)。

某些模塊也存在于非癌癥樣本中，分析配對樣本惡性和非惡性上皮之間表達(dá)每個(gè)模塊的細(xì)胞比例是否存在差異。pEMT模塊在所有四種癌癥類型中的表達(dá)頻率都較高，與腫瘤進(jìn)展中常見的EMT一致。干擾素應(yīng)答模塊在LUAD和SKSC中的表達(dá)頻率增加。相對于正常導(dǎo)管細(xì)胞，PDAC中的鱗狀模塊被誘導(dǎo)，表明惡性細(xì)胞群中的鱗狀分化?；谵D(zhuǎn)錄組學(xué)分析已經(jīng)提出了PDAC的幾種分類，包括經(jīng)典亞型（腺基因的高表達(dá)，包括TFF1和CEACAM6）和基礎(chǔ)亞型（鱗狀和基礎(chǔ)基因的高表現(xiàn)，包括LY6D和KRT15）之間的區(qū)別。雖然胰腺鱗狀細(xì)胞癌癥很少見，但PDAC中鱗狀細(xì)胞表達(dá)頻率的增加表明，向鱗狀細(xì)胞方向的部分化生是常見的。類似地，相對于正常皮膚，腺模塊在LUAD和PDAC中的表達(dá)沒有變化，但在SKSC中的表達(dá)增加。這種模式突出了來源組織表達(dá)的模塊的保留和其他細(xì)胞類型模塊的重組。

3. 腫瘤細(xì)胞鄰域的癌細(xì)胞狀態(tài)分析

利用空間轉(zhuǎn)錄組測序（ST）分析癌癥細(xì)胞狀態(tài)和TME細(xì)胞之間的相互作用。由于這項(xiàng)技術(shù)不是單細(xì)胞分辨率的，使用配對單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了非線性最小二乘（NNLS）回歸，將spot注釋為“惡性”(僅包含惡性細(xì)胞)，“正?！?僅含免疫和基質(zhì)細(xì)胞)，以及“兩者”(都包含)。

每個(gè)樣本中都存在“正?！焙汀皟烧摺钡狞c(diǎn)，能夠分析存在惡性細(xì)胞的情況下，組織的細(xì)胞類型組成是如何變化的。分析發(fā)現(xiàn)，在同樣含有惡性細(xì)胞的spot中，內(nèi)皮細(xì)胞的比例較低，這表明腫瘤的血管化不完全。相反，中性粒細(xì)胞在“兩者”的spot點(diǎn)中的數(shù)量更高。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞被廣泛定義為M1-抗腫瘤/促炎-和M2-促腫瘤/抗炎。對于每個(gè)含有巨噬細(xì)胞的斑點(diǎn)，對其M1/M2極性進(jìn)行評分。在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等六個(gè)婦科樣本中，發(fā)現(xiàn)M1/M2中的“兩者”點(diǎn)高于“正常”點(diǎn)，這表明癌癥細(xì)胞附近具有強(qiáng)大的抗腫瘤巨噬細(xì)胞活性。

為了研究細(xì)胞間通訊關(guān)系，分析了每個(gè)ST樣本中的癌癥細(xì)胞狀態(tài)，對每個(gè)“惡性”點(diǎn)的模塊表達(dá)進(jìn)行了評分。為了表征每個(gè)“惡性”spot點(diǎn)周圍的細(xì)胞類型組成，計(jì)算了兩個(gè)評分指數(shù)，以捕捉其微環(huán)境。將每個(gè)腫瘤的“惡性”spot點(diǎn)的模塊得分和細(xì)胞類型鄰域特征關(guān)聯(lián)起來，可以揭示出TME的癌癥細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞類型如何共同定位形成“鄰域”。在BRCA NYU2腫瘤中，干擾素反應(yīng)模塊和巨噬細(xì)胞成正相關(guān)。為了探索所有樣本之間的這種關(guān)系，計(jì)算了巨噬細(xì)胞鄰域的相關(guān)性得分。在所有樣本中，與干擾素反應(yīng)的相關(guān)性均為陽性，10個(gè)樣本中有8個(gè)樣本具有顯著性。

4. TME對干擾素反應(yīng)的調(diào)節(jié)

癌細(xì)胞和DC細(xì)胞分泌干擾素α和干擾素β，導(dǎo)致T細(xì)胞啟動和抗腫瘤活性。為了進(jìn)一步測試干擾素反應(yīng)與TME中T細(xì)胞之間的關(guān)系，建立了同種異體小鼠癌癥模型，在該模型中TME很容易受到干擾。在四個(gè)原位胰腺腫瘤上進(jìn)行了scRNA-Seq，以驗(yàn)證基因模塊可以在原位模型中重現(xiàn)。與之前一樣，使用NMF識別基因模塊，發(fā)現(xiàn)有五個(gè)重復(fù)的基因模塊：循環(huán)、應(yīng)激反應(yīng)、干擾素反應(yīng)、缺氧和腺分化。

此外，還收集了在Rag1?/-小鼠中形成的四個(gè)原位腫瘤的scRNA-Seq數(shù)據(jù)，分析腫瘤惡性細(xì)胞中的基因模塊表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在Rag1?/-和WT小鼠之間，循環(huán)、應(yīng)激反應(yīng)、缺氧和腺分化的表達(dá)相似。相反，干擾素反應(yīng)模塊在Rag1?/?小鼠的腫瘤中表達(dá)較低。干擾素應(yīng)答模塊的MHC I基因（B2m、H2-D1、H2-K1）在Rag1?/-小鼠中的總體表達(dá)較低（盡管它們在表達(dá)干擾素應(yīng)答的細(xì)胞中保持相對上調(diào)），這表明淋巴細(xì)胞耗竭對MHC I的表達(dá)有額外的影響，與干擾素應(yīng)答無關(guān)的。干擾素應(yīng)答細(xì)胞的頻率也因腫瘤位置而異。

參考文獻(xiàn)：

Barkley Dalia,Moncada Reuben,Pour Maayan et al. Cancer cell states recur across tumor types and form specific interactions with the tumor microenvironment.[J] .Nat Genet, 2022, 54: 1192-1201.