Elabscience直播回放_CCK-8實驗全方位深度解析

• 對數(shù)生長期：細胞生長最快，狀態(tài)最好

• cck8來制作生長曲線來確定細胞是否處于對數(shù)生長期
• cck8橫坐標：培養(yǎng)時間，縱坐標：od值

• ic50

• 活細胞越多，脫氫酶越多，黃色越多

• NC組復孔取平均值

• 空白組：排除培養(yǎng)基與cck8的影響

• ic50: 1- 存活率（抑制率）

• MTT：發(fā)明更早，產(chǎn)物沒有水溶性，需要進一步DMSO溶解
• CCK8：產(chǎn)物無毒無害，水溶性

• 實際接種量：建議在進行CCK8檢測的時候長得最快的那組細胞不能長滿，仍有增殖的空間（防止接觸抑制）
• 移液器的使用：注意槍的氣密性
• 排槍：注意查看槍液面是否平齊
• 單槍：注意中間盡量不要換槍頭
• 讓每個孔細胞的數(shù)量一致
• 空白組的目的：空白組只有培養(yǎng)基+cck8，排除培養(yǎng)基對cck8的影響。注意設置復孔（建議>=3個）
• 細胞混勻：接板的時候注意邊加邊混勻（1.手搖管子；2.槍吹打），防止細胞的沉降
• 鋪板均勻：1.接完96孔板的時候，放回培養(yǎng)箱，不要晃，平穩(wěn)的拿，開門關門要輕柔；2.最好不要十字搖或八字搖
• 減少液體蒸發(fā)：1.接板的時候的，操作迅速，因為安全柜或通風柜會蒸發(fā)液體；2.最外一圈加pbs；3.培養(yǎng)箱最中間蒸發(fā)最少，盡量往中間放
• 1.測量不同時間點需要接不同的板，，減少污染；2.缺氧和加壓實驗，也是要分開接不同的板

• 氧化還原性：考慮加入的物質(zhì)是否有氧化還原性（因為cck8的原理）；有氧化還原性的物質(zhì)，注意加入cck8之前先換液；
• 如何知道自己的物質(zhì)是否存在氧化還原性？通過設置調(diào)零孔（只加培養(yǎng)基+藥物+cck8）
• 藥物顏色：藥物就是黃色就會導致cck8的顏色。只要加入cck8前換液
• PH改變：培養(yǎng)基里面有酚紅，因為酚紅在ph為酸性的時候，導致培養(yǎng)基變成黃色
• 金屬離子：終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5%、15%、90%的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度為10mM，將會100%抑制

換液總體原則：快速輕柔，非必要不換液體

• 快速：目的減少蒸發(fā)
• 輕柔：槍不要把細胞損傷或吸走

換液：一部分一部分換，防止前面的細胞蒸發(fā)導致細胞死亡

藥物可能是有機溶劑溶解的，注意有機溶劑的加入量 < 5/1000，(一個孔200ul，有機溶劑最多加入量： 200 * 5/1000 = 1ul)

水作為溶劑：通常<= 1%(水最多加入量：200 * 0.01 = 2ul)

最好做個溶劑對照，排除溶劑的影響

• cck8孵育時間1-4h；通過od值間接判斷。因為加入的cck8是有限的，酶活性是不變的，隨著時間的延長，導致cck8都被消耗，無法進行比較，建議od在0.2-1.0，這個范圍內(nèi)的線性關系；但是細胞之間總是有差異，最好不要高的太高，低的太低
• 樣本混勻：不建議用酶標儀的混勻功能，它的震動混勻效果通常不是很好。

• 本質(zhì)就是OD值

• 酶標儀平時常用中點法，如果沒有混勻，但是測得出來的復孔差異大

• 處理時間不是越長越好