宿主細胞殘留DNA樣本前處理試劑盒(磁珠法)

本試劑盒用于生物制品樣本前處理，精準抽提各種生物制品中宿主細胞殘留 DNA。適用于多種基質(zhì)緩沖溶液，有效提取純化微量的DNA?？膳c欣協(xié)生物宿主細胞(CHO、E.coli、Vero、SV40LTA&EIA等)DNA(qPCR)檢測試劑盒配合使用。

運輸與保存

藍冰運輸。規(guī)定儲存條件下12個月。

試驗所需自備器材和試劑

• 1×PBS緩沖液(無Mg2+和Ca2+，除菌過濾)

• 異丙醇(分析純)

• 渦旋儀

• 磁力架

• 離心機

• 水浴鍋/金屬浴

• 移液器

• 1.5mL無菌低吸附離心管

• 低吸附吸頭

• 一次性手套

試驗流程

試驗準備

1、每次試驗需要在干凈的試劑瓶中用無水乙醇和滅菌過的超純水配制成新鮮的80%乙醇。

2、單個樣本的結(jié)合液的準備：9μL糖原+0.2μL酵母tRNA(如果提取酵母 DNA，結(jié)合液中不加酵母tRNA)。注：單次吸液量不少于3μL。

3、洗滌液準備：洗滌液使用前加30mL的無水乙醇，充分混勻后使用，同時做好標記，每次使用后將瓶蓋蓋緊，以保持瓶中的無水乙醇含量。

• 樣本準備

  1、樣本稀釋：如果待檢測樣本是生物制品純化過程中的上游中間樣本，可能含有較高的DNA含量。為了保證檢測的準確性，使樣本的檢測值在標準曲線線性范圍之內(nèi)，可以用1×PBS對高DNA含量樣本進行適當比例稀釋后再進行樣本提取，一般可考慮將高DNA含量樣本稀釋100倍或1000倍。

  2、干粉樣本：一般可考慮將干粉樣本稀釋成10mg/mL或100mg/mL，再進行提取操作。

  3、pH值要求：使用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)整樣品的pH至中性(pH6.0~8.0)進行提取。

  4、平行處理：每個樣本建議進行三次DNA提取處理。

  5、樣品加標：待處理樣品的DNA加標濃度為樣品核酸濃度的2-10倍為宜，建議樣品加標體積不超過待處理樣本體積的1/10。

  6、陰性對照：每次試驗需用無模板稀釋液(1×PBS)與待測樣本一同處理。

  
  

• 操作流程

  1、每個待處理樣本取100μL于1.5mL離心管中，待進一步提取。

  2、每個100μL樣本中加入25μL裂解液和10μL蛋白酶K，渦旋震蕩30s，瞬時離心，65℃孵育15min。

  
  

• 提取步驟

  1、孵育完成后將離心管瞬時離心，之后依次加入9.2μL結(jié)合液、50μL裂解液和150μL異丙醇，20μL磁珠(磁珠使用前需充分混勻，確保每次加入的磁珠量均一致，以免造成DNA得率不一致)，渦旋振蕩5min,快速離心10s。

  2、將離心管置于磁力架，輕輕地左右轉(zhuǎn)動，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，保持離心管固定于磁力架上，用移液槍吸去上清，注意不要觸碰磁珠。

  3、加入500μL洗滌液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，渦旋振蕩 30s，確保磁珠分散，離心管壁無聚集磁珠?？焖匐x心10s后將離心管重新置于磁力架上輕輕地左右轉(zhuǎn)動，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，靜置 1min，用移液器小心吸去上清。

  4、加入500μL新鮮配制的80%乙醇，渦旋振蕩30s，確保磁珠分散，離心管壁無聚集磁珠?？焖匐x心10s后將離心管重新置于磁力架上輕輕地左右轉(zhuǎn)動，待磁珠聚集于貼近磁力架的管壁后，靜置1min，用移液器小心吸去上清。

  5、為保證盡量吸出殘留乙醇，可將離心管快速離心10s后，置于磁力架上用10μL移液器吸出殘留乙醇。

  6、打開管蓋室溫干燥3-5min(干燥時間依具體情況進行延長或縮短；肉眼隨時注意觀察，避免磁珠過分干燥)。

  注：干燥過程中磁珠過干或有乙醇殘留都會影響樣本回收率。干燥也可選擇鼓風干燥，一般建議鼓風干燥2min。

  7、將離心管從磁力架取下，每管加入100μL洗脫液，渦旋振蕩1min，70℃孵育7min，期間每2-3min渦旋混勻一次。
  8、孵育完成后，將離心管高速離心1min，然后靜置于磁力架上，待磁珠分離后，用移液器小心轉(zhuǎn)移上清到新的1.5mL離心管中。

  
  

注意事項

1、實驗開始前，為減少污染建議用酒精擦拭臺面、移液器、槍頭盒等表面。

2、注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染。
3、所有試劑需平衡至室溫，再進行實驗。
4、在磁珠洗滌或洗脫過程中，每次振蕩混勻后，都要短時間快速離心，以保證沒有磁珠液附著在離心管管蓋和管壁上。