肝細(xì)胞癌（HCC）已成為世界上最惡性的腫瘤之一，是一種高度致命的癌癥。環(huán)狀RNA （circRNAs）是一種具有閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，通過作為miRNA的分子海綿或與蛋白質(zhì)結(jié)合來調(diào)節(jié)生物過程，也參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲等。circRNA可被包裹成外泌體，參與細(xì)胞間信號傳遞，促進(jìn)多種腫瘤的惡性進(jìn)展。CD8+T細(xì)胞功能障礙是肝細(xì)胞癌（HCC）免疫逃逸的主要因素。然而，外泌體來源的環(huán)狀RNA對CD8+T細(xì)胞功能障礙的影響有待進(jìn)一步探索。

2023年3月，昆明市第一人民醫(yī)院&昆明醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝胰膽外科李立教授課題組在Molecular Cancer（IF=41.444）發(fā)表文章Exosome-derived circCCAR1 promotes CD8+?T-cell dysfunction and anti-PD1 resistance in hepatocellular carcinoma。作者研究發(fā)現(xiàn)，在HCC腫瘤組織和外泌體中存在的環(huán)狀RNA，通過circCCAR1/miR-127-5p/WTAP反饋環(huán)路上調(diào)WTAP，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。HCC細(xì)胞以hnRNPA2B1依賴方式分泌circCCAR1可被活化的CD8+T細(xì)胞吸收，通過增強(qiáng)PD1蛋白的穩(wěn)定性，造成CD8+T細(xì)胞的功能障礙。研究還確定了EP300和EIF4A3作為circCCAR1生物合成的促進(jìn)因子，WTAP介導(dǎo)的m6A修飾作為circCCAR1的穩(wěn)定劑。文章闡述了外泌體衍生circCCAR1促進(jìn)肝細(xì)胞癌CD8+T細(xì)胞功能紊亂和anti-PD1的耐藥性機(jī)制。

circCCAR1在HCC組織中高表達(dá)

首先，作者對HCC患者和健康對照組的血清外泌體進(jìn)行circRNA微陳列檢測其表達(dá)譜。選擇HCC患者血清中外泌體表達(dá)量最高的circCCAR1（hsa_circ_0000240）進(jìn)行下一步分析。作者通過circBase數(shù)據(jù)庫、RT-PCR和Sanger測序確定了circCCAR1的環(huán)化位點(diǎn)。放線菌素D驗(yàn)證circCCAR1穩(wěn)定性。RNA熒光原位雜交FISH驗(yàn)證其定位細(xì)胞質(zhì)。circCCAR1在HCC臨床樣本和細(xì)胞系中的表達(dá)量增加。綜上所述，circCCAR1在HCC組織中高表達(dá)。

circCCAR1在體內(nèi)外均促進(jìn)HCC的生長

作者對circCCAR1在HCC中的可能功能進(jìn)行研究。circCCAR1過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖并增強(qiáng)HCCLM3和SK-Hep-1細(xì)胞的集落形成能力。circCCAR1的過表達(dá)促進(jìn)了異種移植腫瘤的生長。這些數(shù)據(jù)表明，circCCAR1促進(jìn)了HCC在體外和體內(nèi)的生長。

circCCAR1在體內(nèi)外均能促進(jìn)HCC的轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移是癌癥的一個(gè)標(biāo)志，HCC的轉(zhuǎn)移嚴(yán)重?fù)p害了HCC患者的預(yù)后。作者研究發(fā)現(xiàn)circCCAR1的過表達(dá)可以增加HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而其缺失則降低了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在小鼠模型中，circCCAR1過表達(dá)組表現(xiàn)出更多和更嚴(yán)重的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，而其沉默則降低了轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量。總體而言，該研究揭示了circCCAR1在加速HCC細(xì)胞侵襲方面的重要性。

EP300介導(dǎo)的H3K27ac促進(jìn)HCC中circCCAR1的表達(dá)

H3K27ac組蛋白乙酰化在調(diào)控HCC的進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，可以控制circCCAR1或CCAR1的表達(dá)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶抑制劑減少了CCAR1 mRNA和circCCAR1水平。EP300介導(dǎo)的組蛋白乙酰化激活增加了circCCAR1的表達(dá)。結(jié)果表明，EP300介導(dǎo)的組蛋白乙?；せ钤黾恿薱ircCCAR1的表達(dá)。

EIF4A3促進(jìn)circCCAR1的生成

RBPs與circRNA的相互作用可調(diào)節(jié)circRNA產(chǎn)生。研究通過Circ Interactome預(yù)測發(fā)現(xiàn)EIF4A3可結(jié)合到circCCAR1的上游、反向剪接連接位點(diǎn)和下游側(cè)翼序列，并證實(shí)EIF4A3能與一個(gè)上游假定的結(jié)合位點(diǎn)、背剪接連接位點(diǎn)和一個(gè)下游假定的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。MS2 RNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EIF4A3與circCCAR1的上游和下游序列結(jié)合。EIF4A3過表達(dá)可增加HCC細(xì)胞中circCCAR1水平，敲低EIF4A3則相反。RIP和生物素標(biāo)記RNA pull-down實(shí)驗(yàn)佐證了EIF4A3與circCCAR1的相互作用。

WTAP介導(dǎo)的m6A修飾通過IGF2BP3增強(qiáng)了circCCAR1的穩(wěn)定性

MeRIP-qPCR驗(yàn)證了circCCAR1中m6A的富集。作者發(fā)現(xiàn)用MAO靶向circCCAR1五個(gè)不同位點(diǎn)的處理使HCC細(xì)胞表現(xiàn)出更低的circCCAR1水平，RIP和生物素標(biāo)記的RNA pull-down實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證WTAP、IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3四種蛋白都富集在circCCAR1復(fù)合物中。隨后，作者探索WTAP-m6A-IGF2BP3軸在HCC中調(diào)控circCCAR1失調(diào)的潛在機(jī)制，發(fā)現(xiàn)WTAP敲低顯著降低circCCAR1的m6A修飾和IGF2BP3對circCCAR1的結(jié)合，表明IGF2BP3對circCCAR1的結(jié)合依賴于WTAP介導(dǎo)的m6A修飾。總之，WTAP介導(dǎo)的m6A修飾通過IGF2BP3增強(qiáng)了circCCAR1的穩(wěn)定性。研究也發(fā)現(xiàn)circCCAR1通過靶向miR-127-5p上調(diào)WTAP在HCC細(xì)胞中的表達(dá)。

hnRNPA2B1介導(dǎo)的circCCAR1包裝成外泌體

作者發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清與肝癌患者腫瘤組織中circCCAR1表達(dá)水平呈正相關(guān)，可作為預(yù)后診斷指標(biāo)。外泌體抑制劑對HCC細(xì)胞中circCCAR1的水平?jīng)]有影響。HCC細(xì)胞中circcCCAR1的過表達(dá)提高了外泌體circCCAR1的水平，而circCCAR1的敲低降低了外泌體circCCAR1的水平。總之，這些結(jié)果表明circCCAR1可以被包裝成外泌體。作者進(jìn)一步探討了circCCAR1被包裹成外泌體的潛在機(jī)制。通過RIP和RNA pulldown實(shí)驗(yàn)，circCCAR1可以與hnRNPA2B1結(jié)合。此外，circCCAR1在hnRNPA2B1缺失的HCC細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)，而外泌體表達(dá)減少。總之，circCCAR1可以以hnRNPA2B1依賴的方式被包裝成外泌體。

外泌體circCCAR1加速抗腫瘤CD8 + T細(xì)胞的衰竭

腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答來調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展，其中CD8+T細(xì)胞被認(rèn)為是最重要的抗腫瘤細(xì)胞類型。因此，作者研究了外泌體circCCAR1對CD8+T細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞的外泌體被活化的CD8+T細(xì)胞短暫吸收。外泌體circCCAR1共培養(yǎng)降低活化CD8+T細(xì)胞中穿孔素和顆粒酶B的蛋白水平，抑制活化CD8+T細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α的分泌。結(jié)果顯示，外泌體circCCAR1抑制CD8+T細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，降低其細(xì)胞毒性和細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)活化CD8+T細(xì)胞的功能障礙。

circCCAR1促進(jìn)HCC對anti-PD1治療的耐藥性

過表達(dá)circCCAR1通過與β-catenin結(jié)合促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄，從而抑制CD8+T細(xì)胞功能并支持腫瘤生長，而其敲低可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞功能并減緩腫瘤進(jìn)展。此外，circCCAR1也參與了肝癌對anti-PD1治療的抗性，并且與CD8+T細(xì)胞浸潤在肝癌組織中呈負(fù)相關(guān)。

為了探討circCCAR1在anti-PD1治療中的作用，我們構(gòu)建了HuNSG小鼠異種移植模型。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶過表達(dá)circCCAR1細(xì)胞的HuNSG小鼠外周血外泌體circCCAR1增加，CD8+T細(xì)胞低于對照組（圖9B）。circCCAR1高表達(dá)的異種移植小鼠對PD1治療有耐藥性，生存時(shí)間更短。綜上所述，circCCAR1促進(jìn)了HCC的anti-PD1治療耐藥性。

總結(jié)

綜上所述，circCCAR1和CCAR1在HCC中增強(qiáng)，可作為HCC患者的預(yù)后指標(biāo)。circCCAR1/miR-127-5p/WTAP正反饋回路增強(qiáng)了HCC的生長和轉(zhuǎn)移。HCC細(xì)胞分泌的外泌體circCCAR1可被活化的CD8+T細(xì)胞吸收，通過增強(qiáng)PD1蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的功能障礙。此外，HCC細(xì)胞中CCAR1蛋白表達(dá)的增加通過結(jié)合β-catenin促進(jìn)PD-L1的轉(zhuǎn)錄，這可能會增強(qiáng)anti-PD1治療的耐藥性。因此，靶向外泌體circCCAR1或CCAR1可能是一種新的策略，以最大限度地提高HCC患者的免疫治療效率。

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https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-023-01759-1

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