編者按：

腫瘤分子分型：通過NGS、蛋白質(zhì)組等組學技術(shù)，對腫瘤進行分子譜的系統(tǒng)描繪，并根據(jù)分子特征譜，進行腫瘤的精準分類及精準診療研究。

分子分型已成為國家精準醫(yī)療戰(zhàn)略的重點研究投入方向；也備受CNS頂刊雜志青睞。

為了幫助廣大臨床研究者了解腫瘤分子分型及診療研究的重大前沿進展，我們收集整理了近幾年來發(fā)表于Cell、Nature、Cancer Cell等頂刊上的，基于蛋白質(zhì)組及蛋白基因組的腫瘤分子分型相關(guān)研究論文。

【腫瘤分子分型專輯】為大家精細解讀重磅研究與進展。

【癌種】：肺癌

【細分癌種】：肺腺癌（LUAD）

【地域】：中國大陸

【通訊單位】：中國科學院上海藥物研究所 新藥研究國家重點實驗室

【發(fā)表時間】：2020年

【涉及組學】：全外顯子、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、磷酸化修飾蛋白組

【文獻出處】：DOI:https://doi.org/10.1016 / j.cell.2020.05.043

主要成果

1.發(fā)現(xiàn)早期LUAD預(yù)后相關(guān)蛋白和通路，能夠進行預(yù)后分層及治療分類

2.從蛋白質(zhì)組特征和臨床特征將LUAD分為3種亞型，揭示了每種分型的分子特征

3.系統(tǒng)鑒定了與腫瘤進展相關(guān)的磷酸化蛋白以及LUAD亞型特異性激酶

4.篩選到潛在的LUAD預(yù)后標志物和藥物靶點

疾病背景

【流行病學】：肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，5年期生存率低于20%。肺腺癌(LUAD)是非小細胞肺癌(NSCLC)中最常見的組織學亞型，約占肺惡性腫瘤的40%。LUAD最大的致病風險因素是吸煙，其他已報道風險因素主要有長期氡暴露、致癌物、空氣污染等。近年來，非吸煙相關(guān)的LUAD患病率呈逐年上升趨勢。遺傳因素中，TP53、KRAS、KEAP1、STK11和EGFR等驅(qū)動基因是LUAD患者中最常見的體細胞突變類型。值得注意的是，亞洲地區(qū)非吸煙女性的LUAD患病人群中，EGFR突變比例可達40-50%。

【主要驅(qū)動基因】：TP53、KRAS、KEAP1、STK11、EGFR

【治療方案】：LUAD的治療選擇包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療和免疫療法或這些治療的組合。針對靶向免疫檢查點的幾種驅(qū)動基因，以及免疫治療的最新進展取得了顯著的成功。針對EGFR和BRAFV600E突變、ALK和ROS1重排的抑制劑，以及針對PD-1或PD-L1的免疫檢查點抑制劑抗體已被批準用于肺癌的精確治療。但是，仍然有大量的LUAD沒有可選擇的治療方案。此外，靶向治療的耐藥在LUAD病人中較為常見。

研究設(shè)計

【主要樣本】：LUAD肺癌病人經(jīng)手術(shù)切除的癌 VS 癌旁組織

【樣本狀態(tài)】：新鮮冰凍

【樣本數(shù)量】：103 paired

【治療干預(yù)】：手術(shù)前未經(jīng)放化療等干預(yù)

【主要研究路線與內(nèi)容】：

1. 單組學分析：

組別： 癌 VS 癌旁

WES：基因拷貝數(shù)、基因突變

Label free蛋白組：蛋白鑒定與定量數(shù)量；蛋白組與mRNA相關(guān)性分析

Label free磷酸化蛋白組：修飾蛋白、修飾肽段鑒定與定量數(shù)量

2. 整合分析：

LUAD的多組學景觀與蛋白基因組：

1.基因突變概況?

2.蛋白組與磷酸化蛋白組概況?

3.CNA的cis & trans調(diào)控?

4.基因突變的蛋白水平驗證

LUAD組織的蛋白組表達特征：

1.癌VS癌旁組織的蛋白差異表達?

2.腫瘤相關(guān)蛋白與預(yù)后?

3.肺功能相關(guān)蛋白與預(yù)后?

4.早期LUAD的蛋白表達與預(yù)后?

5.驅(qū)動基因EGFR與TP53突變相關(guān)的蛋白表達特征

LUAD的分子分型與預(yù)后：

1.基于蛋白質(zhì)組的分子分型?

2.亞型的預(yù)后?

3.亞型的組織分類?

4.亞型的基因突變特征?

5.亞型的蛋白表達與功能特征?

6.亞型的肺特有蛋白表達特征

LUAD的磷酸化蛋白組特征及臨床意義：

1.癌 VS 癌旁組織的磷酸化差異表達?

2.激酶活性及亞型特征?

3.磷酸化水平與預(yù)后?

4.磷酸化信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

LUAD的預(yù)后生物標志物和藥物靶點發(fā)現(xiàn)：

1.HSP90AB1作為預(yù)后標志物?

2.藥靶注釋與候選藥靶

主要研究成果

一、LUAD樣本的多組學景觀

1. 多種學檢測結(jié)果的統(tǒng)計。多組學分析包括103對癌和癌旁組織的外顯子測序（WES）、51例癌組織和49例癌旁組織轉(zhuǎn)錄組測序、103對樣本蛋白組、79對樣本的磷酸化蛋白組分析，分析的總體情況見下表。

2. WES分析基因突變情況。中國LUAD患者基因突變形式顯著異于白種人患者。中國患者EGFR突變率高達50%，TCGA顯示的白種人患者EGFR突變率為14%。中國患者KRAS突變率為6%，TCGA顯示的白種人患者KRAS突變率達33%。其他突變基因包括TP53 (51%)、DCDC1(7%)、AFF2 (7%)等。

3. 蛋白組和磷酸化蛋白組概況：在癌和癌旁樣本中分別鑒定了11,091和10,793個蛋白，平均每個樣本6,682個蛋白，其中豐度較高的蛋白有HBB、ACTB、HBA1等。共在5,277個蛋白中鑒定到22,564條磷酸化修飾肽段。

結(jié)論：分析了中國人群LUAD基因突變、轉(zhuǎn)錄、蛋白和磷酸化修飾水平差異，鑒定了主要基因突變，中國LUAD患者基因突變形式顯著異于白種人患者，表明不同種族之間的癌癥基因組存在遺傳多樣性。

二、基因拷貝數(shù)變化（CNA）與mRNA/蛋白/磷酸化的表達關(guān)聯(lián)

1. CNA的cis & trans調(diào)控：

(1) cis調(diào)控是指，A基因變化調(diào)控A基因的mRNA、蛋白與磷酸化；trans調(diào)控是指，A基因變化影響B(tài)基因等其他基因的mRNA、蛋白與磷酸化變化。如果基因突變或基因拷貝數(shù)的變化，與蛋白、磷酸化修飾的預(yù)期表達的不一致性，則可能導致基因指導的錯誤應(yīng)用。

(2) 具有cis或trans調(diào)控作用的基因比例：CNA-mRNA（74.4%）、CNA-protein（45.6%）、CNA-磷酸化（18.8%），其中CNA對磷酸化水平的cis調(diào)控遠低于另外兩種類型。

(3) 基因拷貝數(shù)增加最常發(fā)生在7p、7q、1q、20q等染色體區(qū)域，基因缺失最常發(fā)生在13q、9p、9q和15q等染色體區(qū)域。在20個明確定義的LUAD驅(qū)動基因中，EGFR、RIT1、CDKN2A、STK11等四種CNA對mRNA表達具有顯著的cis調(diào)控作用，其中僅EGFR表現(xiàn)出顯著的CNA-protein和CNA-磷酸化cis調(diào)控。

2.?基因突變的蛋白水平驗證：

(1) 蛋白水平突變可以通過WES測序發(fā)現(xiàn)體細胞突變，轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)可變剪接和融合蛋白，再在蛋白組層面通過質(zhì)譜的方式驗證。

(2) 共發(fā)現(xiàn)13,845個單核苷酸變異 (8,630來自WES，6,544來自轉(zhuǎn)錄組)，1,365個插入和缺失突變，其中僅166個（1.2%）突變在蛋白組中出現(xiàn)。另外有0.32%的可變剪接突變和1.59%的新融合蛋白在蛋白組中得到驗證。

結(jié)論：以上分析表明，轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組具有獨特的特征。整合各組學結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因拷貝數(shù)變化與轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性最高，其次為蛋白水平和磷酸化修飾水平，但整體相關(guān)性不高。多組學相結(jié)合能夠發(fā)現(xiàn)更多新的突變帶來的基因產(chǎn)物。

三、腫瘤組織的蛋白組表達特征

1. 整體表達情況：PCA分析顯示癌和癌旁組織中的蛋白組特征存在明確的區(qū)別，表明在LUAD的發(fā)生發(fā)展過程中大量蛋白異常表達。

2. 癌VS癌旁組織的蛋白差異表達：共發(fā)現(xiàn)3,355個蛋白在癌和癌旁組織中差異表達，其中2,749個蛋白在癌組織中上調(diào)表達，606個蛋白下調(diào)表達。癌組織顯著富集的通路包括蛋白酶體、糖酵解或糖異生、核糖體、泛素介導的蛋白水解、細胞周期等途徑。而癌旁組織中富集的蛋白，主要參與肺生理功能相關(guān)通路(肺通氣和免疫功能)。

3.?腫瘤相關(guān)蛋白表達與預(yù)后：COL6A5、ITGA8、MYH10、MAGI1等蛋白在癌組織中低表達表征不良預(yù)后，這些蛋白與細胞基質(zhì)粘附和細胞通訊有關(guān)。PSMD13、CUL2、CDK2、MCM6等蛋白在癌組織高表達，表征不良預(yù)后，這些蛋白參與蛋白穩(wěn)態(tài)、細胞過程等。

Representative proteins from one of the four biological pathways and their association with prognosis.

4. 肺相關(guān)蛋白表達與預(yù)后（AGER、SFTPA2、CACNA2D2、LAMP3、SCGB1A1、SFTPB、SFTPC）：在腫瘤組織中低表達；當患者腫瘤中高表達某些肺富集的蛋白，如AGER、SFTPA2、CACNA2D2等，則可能會有更好的預(yù)后結(jié)果。

四、早期LUAD的蛋白組與預(yù)后

I期LUAD患者中不良預(yù)后組（DP組）和預(yù)后良好（DG組）兩組間的差異：發(fā)現(xiàn)DG組富集的蛋白主要參與脂肪酸代謝、氧化磷酸化等途徑，DP組富集的蛋白主要參與的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及其他炎癥和致癌信號通路，如腫瘤壞死因子 (TNF-α)、mTOR、MYC等。MAOA、ACSS1、ANK1在DG組表達量更高，與良好預(yù)后正相關(guān)；THBS1、PLOD2、IGFBP3高表達表征不良預(yù)后。

五、驅(qū)動基因突變相關(guān)的蛋白表達特征

驅(qū)動基因EGFR和TP53的蛋白水平特征：一些致癌途徑，包括DNA復(fù)制、錯配修復(fù)和剪接體，在TP53突變的患者中發(fā)生了顯著的變化。在EGFR突變患者癌組織中，LUAD的組織學染色標記蛋白TTF-1、NAPSA蛋白表達更高。在TP53突變患者癌組織中，NAPSA蛋白表達更低。EGFR和TP53雙突變患者的生存預(yù)期更差。EGFR和TP53雙突變患者較EGFR單突患者變化的蛋白中，氧化磷酸化、脂肪酸代謝和丙酸代謝途徑下調(diào)，DNA復(fù)制、泛素介導的蛋白水解、蛋白酶體、錯配修復(fù)和細胞周期等致癌途徑上調(diào)。

結(jié)論：描繪了中國人群LUAD患者腫瘤組織中蛋白表達和通路富集特征；發(fā)現(xiàn)了一批能夠標志患者預(yù)后的特征蛋白。

六、LUAD的分子分型與預(yù)后

1.?根據(jù)腫瘤蛋白組特征，將患者分為三個亞型：S-I定義為腫瘤微環(huán)境和新陳代謝型（EM-H），S-II定義為混合型，S-III定義為增殖和蛋白酶體型（PP）。

2.?亞型與預(yù)后：S-I亞型的臨床預(yù)后最好，S-III亞型的臨床預(yù)后最差，三個蛋白質(zhì)組學亞型的TNM I期患者與生存率顯著相關(guān)。

3.?亞型的組織分類特征：S-I分子亞型患者含有更多貼壁樣腺癌（Lepidic）組織學亞型，S-III分子亞型患者的腫瘤分化程度較低，含有更高比例的實性腺癌（Solid）組織學亞型。

4.? 亞型的基因突變特征：（1）S-II亞型具有更高頻率的EGFR突變，S-III亞型的整體突變負荷更高；（2）分析找到WES結(jié)果中9種突變特征與臨床致病風險顯著相關(guān)，包括年齡（signature 1）、吸煙（signature 4）、錯配修復(fù)缺陷（signature 6）、黃曲霉毒素暴露（signature 24）、紫外照射（signature 7）等。突變特征signature 1在非吸煙患者和女性中最常見，且在S-III亞型中頻率最低。

5.? 亞型的蛋白功能特征：S-I亞型富集較多腫瘤微環(huán)境和能量代謝相關(guān)蛋白，參與ECM受體互作、脂肪酸代謝、氨基酸代謝等，還有一些蛋白參與肺通氣和免疫應(yīng)答等肺細胞功能。S-III亞型更多地與蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)和腫瘤增殖有關(guān)，例如核糖體、蛋白酶體、蛋白質(zhì)分解、DNA復(fù)制、補體等相關(guān)蛋白。S-II亞型有兼于S-I和S-III亞型的特征。三種亞型在細胞粘附和細胞周期調(diào)控有各自的特征：一些參與肺細胞功能的蛋白在S-I亞型中高表達，但在S-III亞型中欠表達，這表明S-I亞型與正常組織更接近，而S-III具有更多的惡性特征。

6. 亞型的肺部特有蛋白表達特征：AGER、SFTPA2、CACNA2D2、LAMP3、SCGB1A1、SFTPB、SFTPC）在腫瘤組織中低表達。如患者腫瘤中高表達某些肺富集的蛋白，有更好的預(yù)后結(jié)果，如AGER、SFTPA2、CACNA2D2等。

結(jié)論：以中國人群LUAD患者腫瘤組織中蛋白表達特征為基礎(chǔ)劃分為三個亞型，梳理了三個亞型與臨床預(yù)后和組織學亞型的關(guān)聯(lián)，分析了三個亞型的突變特征以及與臨床致病風險的聯(lián)系，揭示了三個亞型蛋白調(diào)控通路特征?？偟膩碚f，S-I亞型的蛋白表達特征更接近正常肺細胞，預(yù)后也最好，而S-III具有更多的惡性特征。

七、LUAD的磷酸化蛋白組特征及其臨床意義

1. 癌 VS 癌旁組織的磷酸化差異表達：在50%以上患者中檢出1, 244個磷酸化蛋白，其中474個磷酸化蛋白在腫瘤組織中顯著上調(diào)，183個顯著下調(diào)。

2. 激酶激活與亞型特征：發(fā)現(xiàn)了多種在腫瘤中被激活的激酶，如CSNK2A1、MAPK、APK2、CDK1 CDK2、SGK1等。其中一些激酶在三個蛋白組亞型中被特異性激活，如S-I 亞型中的AKT1，S-II亞型中的PRKCE，S-III亞型中的AURKB、PRKCA、MAPK14等。

3. 預(yù)后分析：差異表達的磷酸化蛋白中發(fā)現(xiàn)了與臨床預(yù)后相關(guān)的蛋白，其中CTNNB1、SPTBN1和SNTB1的差異磷酸化在三個蛋白質(zhì)組亞型中均與預(yù)后相關(guān)，這三個蛋白的低磷酸化患者具有更差的生存預(yù)期。蛋白組亞型S-I中參與細胞黏附的多個蛋白具有較高的磷酸化水平，而參與RNA轉(zhuǎn)運的蛋白則顯示較低的磷酸化水平。CAV2蛋白的S23位高磷酸化水平和EIF2S2的S2位低磷酸化水平與不良預(yù)后相關(guān)。

4. 磷酸化信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：根據(jù)磷酸化蛋白表達量與致癌通路中蛋白表達量的相關(guān)性，構(gòu)建了一個磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。多種蛋白可能受到癌癥相關(guān)磷酸化信號的調(diào)控。結(jié)果顯示，CDK13、RSRC2、FOXK1等磷酸化蛋白與細胞周期存在較強的正向調(diào)控作用，CDK13與NOTCH信號通路則存在較強的負調(diào)控作用。

結(jié)論：解析了LUAD的磷酸化蛋白質(zhì)組學特征，找到了各蛋白組亞型中有代表性的調(diào)控激酶及亞型間磷酸化修飾差異，發(fā)現(xiàn)了能夠表征臨床預(yù)后的差異磷酸化修飾蛋白。

八、LUAD中潛在的預(yù)后生物標志物和藥物靶點

利用嚴格的篩選標準，篩選出27個候選蛋白。

1. HSP90AB1預(yù)后標志物：

(1) HSP90AB1蛋白在癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織，HSP90AB1蛋白高表達與不良預(yù)后有關(guān)。

(2) 為了證實HSP90AB1作為LUAD的預(yù)后性生物標志物的潛在價值，本研究使用ELISA在新的驗證隊列檢測了705名LUAD患者和282名健康對照血漿中的HSP90AB1蛋白水平。結(jié)果證實在LUAD患者中HSP90AB1蛋白水平顯著更高。

(3) 分析499例LUAD患者的血漿中HSP90AB1蛋白水平與臨床預(yù)后的關(guān)聯(lián)，結(jié)果表明血漿中HSP90AB1與預(yù)后呈負相關(guān)。

(4) HSP90AB1蛋白的抑制劑對LUAD細胞系的最大抑制濃度中值顯著高于肺鱗癌細胞系，但低于小細胞肺癌細胞系。

2.藥靶注釋與候選藥靶：綜合考慮蛋白的預(yù)后能力、癌和癌旁的差異表達、已有藥物基礎(chǔ)等特性，本研究篩選出CARS、IMPDH2、MCM2、GAPDH、GMPS、CTPS1等11個候選用藥靶點，其中IMPDH2和GAPDH兩個蛋白在腫瘤組織中高表達，且表達量可表征不良預(yù)后。IMPDH2和GAPDH是美國FDA已批準的藥物靶點，可作為LUAD靶向治療的新方向。

結(jié)論：HSP90AB1可作為LUAD診斷和預(yù)后的血漿生物標志物，IMPDH2和GAPDH蛋白可作為LUAD靶向治療的新藥靶。

總結(jié)

該研究使用103例中國LUAD患者的癌和癌旁組織進行了全面的多組學分析，通過蛋白質(zhì)組學、磷酸化蛋白質(zhì)組學、轉(zhuǎn)錄組和全外顯子組測序數(shù)據(jù)，綜合分析顯示了LUAD相關(guān)的特征。從基因突變和拷貝數(shù)變異中發(fā)現(xiàn)了與腫瘤相關(guān)聯(lián)的cis和trans調(diào)控，例如與EGFR和TP53等驅(qū)動基因突變相關(guān)聯(lián)的調(diào)控。蛋白質(zhì)組學分析確定了與患者臨床和分子特征相關(guān)的三個亞型（S-I，S-II和S-III），每個亞型在存活率、遺傳譜、腫瘤細胞代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等方面具有自身特點。從蛋白層面和磷酸化修飾層面找到了一批能夠預(yù)后LUAD臨床結(jié)局的分子，在獨立隊列中驗證了HSP90AB蛋白作為血漿LUAD標志物的診斷和預(yù)后價值，并發(fā)現(xiàn)IMPDH2和GAPDH蛋白可作為LUAD靶向治療的新藥靶。該研究通過蛋白基因組研究全面地解析了LUAD的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和分子特征，提高了對LUAD深層次的生物學理解，為LUAD更精確的診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。