寫在前面

????????今天推薦的是由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院在2019年4月8日發(fā)表于The Journal of Clinical Investigation（2020IF：14.808，JCR 1區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Huibo Wang教授，研究表明USP9X 去泛素化ALDH1A3并維持膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的間充質(zhì)特性。

研究背景

????????膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM) 干細(xì)胞 (GSC) 的間充質(zhì) (MES) 亞型代表了癌細(xì)胞亞群，這些亞群因其高度侵襲性和對常規(guī)治療的抵抗力而臭名昭著。醛脫氫酶 1A3 (ALDH1A3) 最近被認(rèn)為是維持GSC的MES特征的關(guān)鍵決定因素。然而，支持異常ALDH1A3表達(dá)的機(jī)制仍然難以捉摸。

摘要部分

????????作者將泛素特異性蛋白酶9X (USP9X)鑒定為MES GSC中ALDH1A3的去泛素化酶。USP9X與ALDH1A3相互作用、去多聚泛素化并使其穩(wěn)定。此外，作者發(fā)現(xiàn)FACS分選的USP9Xhi細(xì)胞富含具有高ALDH1A3活性和強(qiáng)致瘤能力的MES GSC。USP9X 的消除顯著下調(diào)ALDH1A3，導(dǎo)致MES GSC的自我更新和致瘤能力喪失，這在很大程度上可以通過ALDH1A3的異位表達(dá)來挽救。此外，作者證明USP9X抑制劑WP1130誘導(dǎo)ALDH1A3降解，并在MES GSC衍生的原位異種移植模型中顯示出顯著的治療效果。此外，USP9X與原代人類 GBM 樣本中的ALDH1A3表達(dá)密切相關(guān)，并且對MES亞組患者具有預(yù)后價(jià)值。總的來說，作者的發(fā)現(xiàn)揭示了USP9X作為ALDH1A3蛋白穩(wěn)定的關(guān)鍵去泛素化酶和GSC導(dǎo)向治療的潛在靶點(diǎn)。

研究內(nèi)容

1.USP9X保持ALDH1A3的穩(wěn)定性? ? ?

????????作者使用針對HEK293T細(xì)胞中98個(gè)DUB的siGENOME RTF庫進(jìn)行了RNAi篩選。該初始篩選確定了與ALDH1A3表達(dá)相關(guān)的4個(gè)DUB。作者發(fā)現(xiàn)只有USP9X與ALDH1A3在293T共表達(dá)能夠直接與內(nèi)源性ALDH1A3相互作用。作者隨后將帶有Flag標(biāo)簽的WT USP9X或催化失活的突變體 C1566A USP9X轉(zhuǎn)染到HEK293T 細(xì)胞中。只有WTUSP9X的表達(dá)以劑量依賴性方式增加ALDH1A3蛋白水平，表明USP9X以依賴于其 DUB 活性的方式調(diào)節(jié) ALDH1A3。USP9X 的過表達(dá)或敲低均未改變ALDH1A3mRNA水平。? ? ?

????????作者研究了USP9X是否會影響不同GSC亞型中的ALDH1A3表達(dá)水平。為此，作者從患者的 GBM 細(xì)胞中分離出2個(gè)MES GSC和 2 個(gè)原神經(jīng)GSC作為皮下異種移植物。作者觀察到 MES GSC表現(xiàn)出高水平的USP9X和 CD44 表達(dá)。? ? ?

????????接下來，作者使用慢病毒shRNA敲低細(xì)胞中的USP9X。作者注意到 USP9X敲低顯著降低了ALDH1A3蛋白的表達(dá)，這可以通過添加蛋白酶體抑制劑 MG132 或shRNA抗性WT的過度表達(dá)逆轉(zhuǎn)。相反，當(dāng)USP9X在細(xì)胞中異位表達(dá)時(shí)，ALDH1A3的表達(dá)顯著增加。USP9X敲低或過表達(dá)對ALDH1A3 mRNA水平?jīng)]有顯著影響。為了證明USP9X可以影響 ALDH1A3本身的穩(wěn)定性，作者使用CHX停止蛋白質(zhì)合成并檢測USP9X操作后的ALDH1A3蛋白質(zhì)水平。WTUSP9X的過表達(dá)導(dǎo)致HEK293T細(xì)胞中異位表達(dá)的ALDH1A3蛋白的穩(wěn)定性顯著增加，而在 MES 21和505 GSC中敲低USP9X表達(dá)導(dǎo)致ALDH1A3蛋白不穩(wěn)定。

研究結(jié)論：USP9X特異性調(diào)節(jié)ALDH1A3穩(wěn)定性。

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2.USP9X與ALDH1A3相互作用??? ?

????????作者接下來試圖確定USP9X是否直接與ALDH1A3相互作用。Co-IP分析表明，在HEK293T細(xì)胞和NHA中的Flag-USP9X WT或Flag-USP9X C1566A免疫沉淀物中可以很容易地檢測到 ALDH1A3，表明這種相互作用不需要DUB活性。同樣，內(nèi)源性USP9X和ALDH1A3蛋白之間的物理關(guān)聯(lián)在MES 21和505 GSC中得到驗(yàn)證。

????????此外，純化的USP9X WT或其C1566A突變體能夠與GST-ALDH1A3結(jié)合，但不能單獨(dú)與GST結(jié)合，從而證實(shí)USP9X和ALDH1A3之間的相互作用是直接的。截?cái)嗤蛔兎治霰砻?，USP9X的N端序列（氨基酸 1-600）和ALDH1A3的N端序列（氨基酸 1-200）都是相互直接相互作用所必需的。

研究結(jié)論：USP9X與ALDH1A3相互作用。

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3.USP9X去泛素化ALDH1A3

????????通過IP用 MG132 處理的細(xì)胞ALDH1A3，作者觀察到ALDH1A3被大量泛素化。然而，WT USP9X 的共表達(dá)幾乎完全消除了ALDH1A3泛素化，而C1566A突變體USP9X沒有這種效果。相反，對USP9X的下調(diào)顯著增加了MES 21和505 GSC中的ALDH1A3多泛素化。為了證明ALDH1A3是USP9X的直接去泛素化底物，作者將多泛素化ALDH1A3與純化的GST-USP9X WT或GST-USP9X C1566A一起孵育。作者發(fā)現(xiàn)僅有純化的 GST-USP9X WT，能夠與ALDH1A3相互作用，表明USP9X通過直接去除其泛素化來穩(wěn)定ALDH1A3。作者還發(fā)現(xiàn)USP9X有效地分解了ALDH1A3的Lys48連接的多泛素化，但對ALDH1A3的非降解性Lys63連接的多泛素化沒有顯著影響。

研究結(jié)論：USP9X是一種靶向ALDH1A3蛋白進(jìn)行去泛素化的DUB。

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4.USP9X的高表達(dá)預(yù)示著ALDH1A3hi MES GSCs的富集具有較強(qiáng)的致瘤能力? ?

????????作者將 MES 21 和 505 GSC分成表達(dá)高 (USP9Xhi) 或低 (USP9Xlo)USP9X水平的亞群。正如預(yù)期的那樣，與USP9Xlo亞群相比，ALDH1A3在USP9Xhi?亞群中高度表達(dá)。此外，ALDEFLUOR測定的結(jié)果顯示USP9Xhi亞群表現(xiàn)出比 USP9Xlo亞群顯著更高的ALDH1活性。

????????接下來，作者使用穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲熒光素酶的USP9Xhi和USP9Xlo細(xì)胞進(jìn)行了顱內(nèi)植入。體內(nèi)生物發(fā)光成像表明，只要500 USP9Xhi細(xì)胞就足以在60天內(nèi)建立腫瘤。形成鮮明對比的是，腫瘤起始至少需要50000 USP9Xlo細(xì)胞。免疫組織化學(xué)分析表明，攜帶USP9Xhi細(xì)胞衍生腫瘤的小鼠表現(xiàn)出高水平的 ALDH1A3，而攜帶 USP9Xlo?細(xì)胞衍生腫瘤的小鼠對該分子呈陰性或僅微弱陽性。

研究結(jié)論：USP9X的高表達(dá)可能意味著具有強(qiáng)大致瘤能力的ALDH1A3hi?MES GSC的大量富集。

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5.USP9X表達(dá)的降低會損害MES GSC的自我更新、致瘤性和放射/化學(xué)抗性? ? ?

????????作者接下來研究MES GSC的自我更新和致瘤性是否需要USP9X。研究發(fā)現(xiàn)USP9X 的沉默大大減弱了細(xì)胞生長并減少了DNA復(fù)制。此外，敲低USP9X表達(dá)顯著降低了 MES21和505 GSC的腫瘤球形成頻率。在USP9X敲低的MES GSC中觀察到ALDH1A3和CD44以及主要MES特異性標(biāo)志物的表達(dá)降低。作者接下來檢查了USP9X敲低對體內(nèi)MES GSC致瘤潛力的影響。將shRNA(shCtrl) 或 shUSP9X 轉(zhuǎn)導(dǎo)的熒光素酶標(biāo)記的MES GSC 21或505顱內(nèi)注射到小鼠中。與植入shCtrl轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠相比，植入shUSP9X轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠顯示出更長的生存期，腫瘤形成率較低。? ? ?

????????作者發(fā)現(xiàn)ALDH1A3可以在很大程度上回補(bǔ)USP9X敲低對細(xì)胞增殖、自我更新和致瘤潛力的抑制作用。這些結(jié)果表明USP9X/ALDH1A3軸在維持GSC的MES特征中的重要功能。

????????作者用空的或USP9X慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)PN 35和182 GSC（兩種細(xì)胞株USP9X表達(dá)量低），并用電離輻射或替莫唑胺處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)在PN GSCs中USP9X的強(qiáng)制表達(dá)賦予了對IR和TMZ的抗性，而USP9X的敲低增強(qiáng)了PN GSCs對IR和TMZ的敏感性。這些結(jié)果表明USP9X可能有助于獲得PN GSC中的放射/化學(xué)抗性。

?研究結(jié)論：USP9X的表達(dá)降低會損害MES GSC的自我更新、致瘤性和放射/化學(xué)抗性。

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6.USP9X 的藥理學(xué)抑制減弱了具有高ALDH1A3活性的 MES GSC 的腫瘤啟動能力? ? ?

????????作者隨后研究了USP9X藥理抑制對MES GSC衍生的GBM模型的影響。作者使用了USP9X小分子抑制劑 WP1130。研究發(fā)現(xiàn)1 μmol/lWP1130幾乎完全消除了USP9X從多泛素化ALDH1A3中去除泛素部分的能力。相應(yīng)地，WP1130 處理降低了MES 21和505 GSC中的ALDH1A3蛋白水平，而不影響其mRNA水平。此外，WP1130 顯著抑制MES 21和505 GSC中的ALDH1 活性。

????????接下來，作者檢查了MES 21 和 505 GSC對WP1130的敏感性。作者發(fā)現(xiàn)用WP1130處理MES GSC 導(dǎo)致細(xì)胞增殖和腫瘤球形成能力的顯著抑制，伴隨著 MES 特征的消失。然后，作者評估了WP1130對患有源自MES 21和505 GSC的顱內(nèi)腫瘤的小鼠的治療效果。與作者的體外研究結(jié)果一致，通過7天連續(xù)CED輸注WP1130，接受WP1130治療的荷瘤小鼠與載體治療的小鼠相比顯示出腫瘤生長減慢和存活率提高。免疫組織化學(xué)分析所示在這些腫瘤中，USP9X、ALDH1A3和CD44的表達(dá)水平被WP1130強(qiáng)烈減弱。

研究結(jié)論：USP9X的藥理學(xué)抑制可能通過促進(jìn)ALDH1A3不穩(wěn)定來有效消除MES GSC。

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7.USP9X 與ALDH1A3蛋白水平呈正相關(guān)，并且與 ALDH1A3hi MES GBM 的存活率低有關(guān)

????????最后，作者對組織微陣列中的USP9X、ALDH1A3（MES GBM 標(biāo)記）和OLIG2（PN GBM 標(biāo)記）進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色。USP9X與ALDH1A3表達(dá)密切相關(guān)，與OLIG2相互排斥。此外，Kaplan-Meier 生存分析表明USP9X表達(dá)水平對OLIG2hi GBM 患者的患者生存沒有預(yù)測價(jià)值。相比之下，USP9Xhi?GBM 患者在 ALDH1A3hi?患者組中的總生存期和無進(jìn)展生存期顯著縮短，表明USP9X對 MES 亞組內(nèi)的患者具有預(yù)后價(jià)值。

研究結(jié)論：人類GBM數(shù)據(jù)與作者在GSC中USP9X介導(dǎo)的ALDH1A3穩(wěn)定和相關(guān)MES特征的實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈一致。

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結(jié)論與討論

????????在這項(xiàng)研究中，作者證明USP9X可調(diào)節(jié)ALDH1A3多泛素化和穩(wěn)定性。作者發(fā)現(xiàn)USP9X是預(yù)測ALDH1A3hi MES GSC富集的關(guān)鍵分子，并且是MES GSC自我更新和致瘤性所必需的。作者還評估了USP9X抑制對患者來源的MES GSC異種移植模型的潛在治療效果?？傊?，該研究將USP9X鑒定為穩(wěn)定ALDH1A3并保持其高活性的關(guān)鍵去泛素化酶，USP9X的去泛素化作用可以維持GSC的MES特性、自我更新和致瘤能力。因此，通過USP9X的藥理學(xué)抑制來穩(wěn)定ALDH1A3可能為GBM的治療干預(yù)開辟一條途徑。

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