前言

人類嚴(yán)重急性呼吸窘迫綜合征冠狀病毒(SARS-CoV-2) 感染會(huì)導(dǎo)致多種臨床表現(xiàn)，從無(wú)癥狀疾病到急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS) 和多器官衰竭。除了病毒對(duì)呼吸系統(tǒng)和其他器官的直接損傷外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，由 SARS-CoV-2 感染引起的免疫反應(yīng)有助于冠狀病毒病 (COVID-19) 的病理生理學(xué)，尤其是在嚴(yán)重的疾病過(guò)程中。

CD4 T 輔助細(xì)胞和 CD8細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞 (CTL) 都有助于控制呼吸道病毒感染。T 細(xì)胞免疫反應(yīng)與 COVID-19 期間疾病結(jié)果之間存在復(fù)雜的關(guān)系。微環(huán)境中存在的其他因素可能會(huì)影響 T 細(xì)胞反應(yīng)的質(zhì)量，從而影響病理學(xué)。因此，重要的是確定哪些 T 細(xì)胞亞群具有致病作用？

2022年02月，德國(guó)柏林夏里特醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)在 Cell期刊（IF：66.850）發(fā)表了題為 “Complement activation induces excessive T cell cytotoxicity in severe COVID-19”的研究成果，采用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)(CyTOF)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法，評(píng)估COVID-19重度過(guò)程中致病T細(xì)胞的功能和誘導(dǎo)信號(hào)，發(fā)現(xiàn)了患者體內(nèi)的補(bǔ)體激活可使其T細(xì)胞過(guò)度毒性。表明T細(xì)胞毒性加劇和補(bǔ)體激活使得COVID-19患者患重度疾病或死亡的風(fēng)險(xiǎn)增大。

研究背景

本篇作者將單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)與機(jī)制研究相結(jié)合，揭示 T 細(xì)胞區(qū)室的改變及它們的上游信號(hào)和功能相關(guān)性，解釋了在嚴(yán)重 COVID-19 中觀察到的重要免疫病理學(xué)特征。大規(guī)模細(xì)胞術(shù)（飛行時(shí)間細(xì)胞術(shù) [CyTOF]）和單細(xì)胞 RNA-seq (scRNA-seq) 結(jié)合基于 VDJ 測(cè)序 (VDJ-seq) 的 T 細(xì)胞克隆型鑒定用于確定 COVID-19 和嚴(yán)重程度-T細(xì)胞區(qū)室的特異性改變。

作者描述了 C3a 驅(qū)動(dòng)對(duì)COVID-19 重癥患者的活化 CD16 表達(dá)細(xì)胞的誘導(dǎo)。這些 T 細(xì)胞表現(xiàn)出增加的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的、不依賴于 TCR 的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致肺內(nèi)皮細(xì)胞激活和釋放趨化因子。這種機(jī)制可能導(dǎo)致 COVID-19 患者出現(xiàn)嚴(yán)重的肺損傷和內(nèi)皮炎。

研究思路

研究結(jié)果

1.嚴(yán)重的 COVID-19 中表達(dá)CD4、CD8 TCRab和 TCRgd T 細(xì)胞

作者對(duì)急性和恢復(fù)期的輕度和重度 COVID-19 患者、患有其他急性呼吸道感染（流感樣疾病）的患者以及慢性感染人類免疫缺陷病毒 (HIV) 或乙型肝炎 (HBV) 和對(duì)照組（圖1A）。為了進(jìn)一步探究 T 細(xì)胞空間，將獲得的 T 細(xì)胞（CD45 CD3 CD19 - CD15 -）預(yù)先門(mén)控到 CD4T 輔助細(xì)胞（CD3，CD8 - TCRgd -），CD8CTLs（CD3，CD8 TCRgd - ) 和 TCRgd (CD3 - , CD8 - TCRgd + ) 細(xì)胞使用 29 種表面抗原標(biāo)記。對(duì)來(lái)自對(duì)照、FLI、HIV、HBV 和急性 COVID-19 的樣本進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類分析，對(duì)預(yù)先門(mén)控的 T 輔助細(xì)胞、CTL 和 TCRgd 進(jìn)行分區(qū)T 細(xì)胞分別分為 19、15 和 14 個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞簇（圖 1 B-1D）。

來(lái)自輕度或重度 COVID-19 患者的大部分細(xì)胞在統(tǒng)形逼近和降維投影 (UMAP) 空間中與其他患者組或?qū)φ战M的細(xì)胞明顯分離（圖 1B）。與其他組相比，輕度和重度 COVID-19 患者的簇 25 T 細(xì)胞（CD8 CD38 hi HLA-DR Ki67 ）的比例增加（圖1D 和 1E）。重癥 COVID-19 的進(jìn)一步特征是簇 26 T 細(xì)胞（CD8，高度活化的 NKT 樣細(xì)胞）的豐度增加，也表達(dá)高水平的 CCR6 和 CD16。

圖1 | HLA-DR hi CD38 hi高度活化但也表達(dá) CD16 的 CD4和 CD8 T 細(xì)胞在重癥 COVID-19 中的積累

2.單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示重癥 COVID-19 中 T 細(xì)胞向高細(xì)胞毒性和脫粒潛力轉(zhuǎn)變

為了獲得有關(guān) COVID-19 和嚴(yán)重程度特異性 T 細(xì)胞簇的功能信息，作者對(duì)來(lái)自急性感染和恢復(fù)期輕度和重度 COVID 的外周血單核細(xì)胞 (PBMC) 樣本以及純化的表達(dá) CD38 的 T 細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組scRNA-seq 分析，并對(duì)齊 CyTOF 和 scRNA-seq T 細(xì)胞簇，得到了 17 個(gè)簇（圖 2A和2B)。與 FLI 或 HBV 患者以及對(duì)照組相比，COVID-19 患者中屬于第 7、8 和 10 組的 T 細(xì)胞比例更高（圖 2D 和 2E)。作者觀察到其他具有FCGR3A表達(dá)的 T 細(xì)胞簇（簇 9、11、12 和 13）。

接下來(lái)，作者對(duì)集群 7、8、9 和 10 進(jìn)行了基因本體論 (GO) 富集分析，比較了輕度和重度 COVID-19 T 細(xì)胞（圖 2F）。作者觀察到重癥 COVID-19 T 細(xì)胞脫粒相關(guān)基因的特定富集，接著對(duì)選擇性富集通過(guò)基因集富集分析進(jìn)行基因驗(yàn)證。

對(duì)來(lái)自隊(duì)列的樣本進(jìn)行的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)scRNA-seq 分析支持了作者在重癥 COVID-19 的主要 T 細(xì)胞區(qū)室中發(fā)現(xiàn)了一部分活化的 CD16T 細(xì)胞，并確定了與細(xì)胞毒性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序的增加。

圖2 | 急性輕度和重度 COVID-19 期間 T 細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)

來(lái)自對(duì)照組 (n = 6)、FLI (n = 8)、HBV (n = 4)、輕度 COVID-19 (n = 9) 和重度 COVID-19 (n = 10) 的 T 細(xì)胞簇的 UMAP患者。

3.CD16 介導(dǎo)的 CD8T 細(xì)胞脫粒導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞釋放趨化因子

CyTOF 和 scRNA-seq 分析確定了兩個(gè)主要的 T 細(xì)胞活化特征：(1) 形成高度活化、增殖的 TFH 樣 CD4細(xì)胞和表達(dá) CXCR3 的 CTL，與疾病嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)；(2) 活化的 CD16 T 細(xì)胞特異性。作者測(cè)試了 SARS-CoV-2 特異性抗體反應(yīng)在這些患者中是否更明顯？SARS-CoV-2 特異性 IgA 的血清濃度，結(jié)果顯示，特定 IgG 水平在重癥 COVID-19 中更高（圖 3A）。

接下來(lái)，作者研究了與 CD16CD4和 CD8簇相關(guān)的功能特性。如 scRNA-seq 所示，與對(duì)照組相比，來(lái)自重癥 COVID-19 患者的樣本含有明顯更多的表達(dá)粒酶 B 的 CD8T 細(xì)胞（圖 3C）。

CD16 參與重癥 COVID-19 可能的影響之一是在與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用期間 T 細(xì)胞脫粒增強(qiáng)。事實(shí)上，根據(jù)對(duì)重癥 COVID-19 的尸檢結(jié)果，已經(jīng)觀察到 T 細(xì)胞浸潤(rùn)和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，即淋巴細(xì)胞性內(nèi)皮炎。可以想象，免疫復(fù)合物介導(dǎo)的 CD16T 細(xì)胞脫粒會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮損傷。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者在抗 CD16 抗體存在的情況下，將原代肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞與從輕度/重度 COVID-19 患者/對(duì)照中分離的富集的非初始 CD8 T 細(xì)胞共同培養(yǎng)。隨后，作者分析了炎癥介質(zhì)的釋放（圖3G）?？?CD16 觸發(fā)的嚴(yán)重 COVID-19 T 細(xì)胞通過(guò)共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞引起增強(qiáng)的 CXCL8 (IL-8) 和 CCL2 (MCP-1) 釋放。與對(duì)照 T 細(xì)胞相比，來(lái)自 COVID-19 患者的 T 細(xì)胞放大了伴刀豆球蛋白 A 誘導(dǎo)的跨內(nèi)皮電阻損失，表明內(nèi)皮屏障破壞，但這種效應(yīng)僅對(duì)來(lái)自重癥 COVID-19 患者的 T 細(xì)胞顯著（圖 3 H ）。

為了補(bǔ)充作者在外周血中的發(fā)現(xiàn)，作者研究了COVID-19 患者肺部CD16 T 細(xì)胞的組織定位。作者發(fā)現(xiàn)與來(lái)自不同對(duì)照尸檢組的肺組織相比，CD3 CD16 ?T 淋巴細(xì)胞的數(shù)量增加（圖 3 I 和 3J）。并在死亡的晚期時(shí)間點(diǎn)下降（圖 3 J）。

這些發(fā)現(xiàn)支持作者的假設(shè)，即在重癥 COVID-19 患者中 CD16高細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的生成和局部積累增強(qiáng)，可誘導(dǎo)肺內(nèi)皮細(xì)胞的活化和損傷。T 細(xì)胞誘導(dǎo)的化學(xué)引誘劑 CXCL8 和 CCL2 的釋放可導(dǎo)致 COVID-19 肺炎中中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤(rùn)增加。

圖3 | 重癥 COVID-19 的 T 細(xì)胞的脫粒和細(xì)胞毒性潛力增加

4. 在急性重癥 COVID-19 期間誘導(dǎo)的表達(dá)FCGR3A的 T 細(xì)胞克隆持續(xù)存在并保持其增加的細(xì)胞毒性潛力

來(lái)自重癥 COVID-19 患者的 CD16 T 細(xì)胞表現(xiàn)出增強(qiáng)的細(xì)胞毒性特性，可能導(dǎo)致器官損傷，作者分析了它們?cè)谇宄毙愿腥竞蟮某志眯?。癥狀發(fā)作后 3-8 個(gè)月恢復(fù)期（圖 4A -4E），作者分析了單個(gè) COVID-19 T 細(xì)胞簇的克隆富集是否不同。進(jìn)一步揭示這些克隆的高細(xì)胞毒性潛力。隨后探索富含反應(yīng)性缺氧特征的區(qū)域。結(jié)果顯示，重癥 COVID-19 患者的 CD16 CD8 T 細(xì)胞在恢復(fù)期持續(xù)存在，采用更分化的 CD62L -表型，但仍保持其高細(xì)胞毒性潛力。

圖4 | 在急性 COVID-19 期間擴(kuò)增的 T 細(xì)胞克隆的時(shí)間依賴性進(jìn)化和表型

5. C3a 促進(jìn)表達(dá) CD16 的高細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的分化

因?yàn)?COVID-19 的死亡率和嚴(yán)重發(fā)病率會(huì)不同程度地影響老年人，作者研究了總 CD16 T 細(xì)胞的形成是否與年齡增加有關(guān)。作者利用已發(fā)表的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)揭示了來(lái)自老年人的樣本中檢測(cè)到顯著更高比例的 CD16細(xì)胞，這支持了作者的年齡依賴性增加的假設(shè)（圖 5 A）。

重癥 COVID-19 的一個(gè)關(guān)鍵特征是補(bǔ)體生成和激活增加，作者分析了補(bǔ)體成分補(bǔ)體因子 D (CFD) 與年齡的相關(guān)性。接下來(lái)，作者在重組 IL-2 和來(lái)自輕度或重度 COVID-19 患者的血清或?qū)φ昭宓拇嬖谙?，用板結(jié)合的抗 CD3/CD28 抗體刺激來(lái)自健康未暴露對(duì)照的富集 CD3細(xì)胞。作者測(cè)試了 C3a 是否是導(dǎo)致重癥 COVID-19 患者血清 T 細(xì)胞分化潛能改變的原因。

總之，在重癥 COVID-19 中高水平產(chǎn)生的補(bǔ)體分裂產(chǎn)物（如 C3a）會(huì)產(chǎn)生炎癥環(huán)境，促進(jìn) CD16高細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞的分化。

圖5 | C3a促進(jìn)表達(dá)CD16的高細(xì)胞毒性T細(xì)胞分化

6.活化的 CD16 T 細(xì)胞在嚴(yán)重 COVID-19 期間的病理作用

作者比較了死于 COVID-19 的患者和幸存者中活化 CD16T 細(xì)胞的比例。與幸存者（幸存者）相比，死亡的重癥 COVID-19 患者（非幸存者）樣本中所有 CD4和 CD8 T 細(xì)胞中活化的 CD16 TCRab細(xì)胞的百分比顯著更高（圖 6 A）。

接下來(lái)，作者在更大的隊(duì)列中測(cè)試了 C3a 生成上游補(bǔ)體蛋白的血漿水平是否與患者的病程和結(jié)果相關(guān)。與輕度 COVID-19 相比，重癥患者血漿樣本中經(jīng)典和替代途徑的正調(diào)節(jié)因子水平較高（圖6B ）。作者還分析了與疾病軌跡相關(guān)的補(bǔ)體蛋白水平，特別是隨后疾病嚴(yán)重程度的惡化。臨床惡化的患者樣本中 C1R 和 CFD 升高，而隨后疾病進(jìn)展的患者樣本中抑制經(jīng)典和凝集素依賴性補(bǔ)體途徑的補(bǔ)體因子 I (CFI) 的豐度較低（圖 6C）。C1QA、C1QB、C1QC 和 CFD 的數(shù)量不僅在重癥 COVID-19 中較高，而且與致命結(jié)果相關(guān)（圖 6 D）。

總之，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了補(bǔ)體系統(tǒng)和活化的 CD16 T 細(xì)胞在嚴(yán)重 COVID-19 期間的病理作用。

圖6 | 活化 CD16 T 細(xì)胞的比例和血漿補(bǔ)體蛋白水平與 COVID-19 的結(jié)果相關(guān)

相關(guān)討論

過(guò)度的 T 細(xì)胞活化和改變的表型可能導(dǎo)致感染相關(guān)的器官損傷。在重癥 COVID-19 患者中，作者檢測(cè)到活化的 CD16T 細(xì)胞的分化，這顯示出免疫復(fù)合物介導(dǎo)的細(xì)胞毒性潛力和激活肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的潛力。CD16 中的擴(kuò)展克隆+ T 細(xì)胞區(qū)室持續(xù)存在并保持其高細(xì)胞毒性潛力。作者將 C3a 鑒定為分化改變的活化 T 細(xì)胞表型的上游信號(hào)?；罨?CD16T 細(xì)胞的比例和血漿補(bǔ)體蛋白豐度水平與重癥 COVID-19 患者的不良預(yù)后相關(guān)。因此，SARS-CoV-2 觸發(fā)的補(bǔ)體激活創(chuàng)造了一種炎癥環(huán)境，驅(qū)動(dòng)具有高免疫致病潛力的 T 細(xì)胞分化。在這里，作者顯示重癥 COVID-19 患者中 C3a 生成的增加促進(jìn)了 CD16、高細(xì)胞毒性 CD4和 CD8 T 細(xì)胞的分化。

總結(jié)全文，研究發(fā)現(xiàn)新冠重癥患者體內(nèi)出現(xiàn)高度活化、高細(xì)胞毒性的CD16T細(xì)胞亞群。新冠重癥患者體內(nèi)免疫復(fù)合物介導(dǎo)的CD16 T細(xì)胞可以與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、釋放炎性趨化因子以及中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)肺組織。而CD16 T細(xì)胞克隆在急性疾病后仍能保持其細(xì)胞毒性表型。補(bǔ)體成分C3a作為其上游信號(hào)可以促進(jìn)高毒性CD16T細(xì)胞的分化?；罨疌D16T細(xì)胞的比例和血漿補(bǔ)體蛋白水平與新冠患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，表明T細(xì)胞的高毒性和補(bǔ)體激活使得新冠患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加。

總之，特別嚴(yán)重的 COVID-19 導(dǎo)致活化的 CD16 ?T 細(xì)胞數(shù)量增加，這些細(xì)胞通過(guò)不依賴 TCR 的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞功能觸發(fā)補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)與內(nèi)皮損傷和患者存活相關(guān)。這在功能上將先天和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)與內(nèi)皮損傷聯(lián)系起來(lái)，這可能構(gòu)成一個(gè)重要的分子軸，解釋了在 COVID-19 中觀察到的廣泛的器官損傷。

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該研究團(tuán)隊(duì)將單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)（CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)與機(jī)制研究相結(jié)合，揭示了T細(xì)胞室的改變、上游信號(hào)和功能相關(guān)性，詳細(xì)闡述了重癥covid-19患者中的致病性T細(xì)胞的功能和誘導(dǎo)信號(hào)。研究方法上，創(chuàng)新性的將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)、單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)與機(jī)理研究相結(jié)合。

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