近年來，單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展方興未艾，因在揭示細胞異質(zhì)性和新細胞亞群研究中具有的獨特優(yōu)勢，受到了眾多科研工作者的青睞。但是單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)卻無法獲取細胞在組織中的空間位置信息，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)正好可以解決這一問題。單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的聯(lián)合分析，實現(xiàn)了對組織原位細胞真實基因表達的研究，更加精確的解析復雜組織的結(jié)構(gòu)，同時還能大幅度提升文章檔次。

下面，小編跟大家分享一篇單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)聯(lián)合分析的文章。

一、研究背景

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是繼肺癌和乳腺癌后的第三大常見惡性腫瘤，每年造成全球約80萬人死亡，且除手術(shù)外治療方法有限。繼免疫檢查點抑制劑(ICB)雖被應用于CRC治療。但靶向PD-1的帕姆利珠單抗僅對高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（high microsatellite instability， MSI-H）的錯配修復缺陷腫瘤有效，該類腫瘤占轉(zhuǎn)移性CRC病例的比例<5%。因此，有必要了解結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)中細胞和分子重塑的機制，尋找潛在的干預靶點，增強免疫治療的療效從而提高患者生存率。

研究表明，基質(zhì)細胞和髓樣細胞可能形成腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的獨特生態(tài)位。肌成纖維細胞和癌癥相關成纖維細胞在結(jié)直腸癌腫瘤中富集，且肌成纖維細胞相關基因標記也被確定為CRC共識分子亞型的主要特征之一，該亞型的定義是腫瘤基質(zhì)富集和TGF-β信號介導的細胞外基質(zhì)重塑。另外有研究證實，腫瘤肌成纖維細胞可能是腫瘤驅(qū)動的基質(zhì)群體。因此迫切需要了解基質(zhì)亞型的確切功能，特別是它們與TME中其他細胞的串擾。因單細胞轉(zhuǎn)錄組測序(scRNA-seq)在解析細胞間異質(zhì)性方面的獨特優(yōu)勢，成為研究CRC TME中基質(zhì)細胞與其他類型細胞相互作用的有力工具。

二、材料方法

1.???? 樣本信息：5例CRC患者的腫瘤組織和鄰近正常組織，其中2例為結(jié)腸癌，3例為直腸癌；

2.???? 技術(shù)手段：5例CRC患者腫瘤和正常組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，4例腫瘤組織切片進行空間轉(zhuǎn)錄組測序，同時結(jié)合流式細胞術(shù)和免疫熒光染色輔助驗證；

3.???? 生信分析內(nèi)容：降維與聚類分析（Seurat v3）、機器學習建模（RandomForest）差異表達分析（Seurat v3）、軌跡分析（Velocyto）、轉(zhuǎn)錄因子分析（pySCENIC）、細胞型浸潤分析（CIBERSORTx）、生存分析（Survival）、GSEA（Seurat v3）、細胞通訊（NicheNet）、空間轉(zhuǎn)錄組分析（Space ranger）；

4.???? 運用的公共數(shù)據(jù)庫信息：TCGA-COAD和READ隊列RNA-seq數(shù)據(jù)、GEO數(shù)據(jù)庫中12個獨立的CRC隊列RNA-seq數(shù)據(jù)以及IMvigor210公共數(shù)據(jù)集。

三、主要結(jié)果

1．結(jié)直腸癌組織和正常組織的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

為了闡明結(jié)直腸腫瘤的細胞組成，手術(shù)獲取的5例CRC患者的腫瘤組織和鄰近正常組織進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序?？偒@得54103個細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析，其中29481個細胞來自鄰近正常組織，24622個細胞來自腫瘤組織(圖1b)。細胞被分為9種主要細胞類型(圖1b-d)，包括上皮細胞、T細胞、B細胞、漿細胞、髓樣細胞、肥大細胞、內(nèi)皮細胞（ECs）、間充質(zhì)干細胞（MSCs）、神經(jīng)膠質(zhì)細胞。雖然所有細胞類型在每位患者的腫瘤和正常組織中均存在(圖1e)，但每類細胞的浸潤程度不同，這可能反映了不同的CRC發(fā)展階段。

2．結(jié)直腸癌患者腫瘤組織中細胞群的特征揭示了TME的標志性特征并預測了臨床結(jié)果

為了研究腫瘤浸潤細胞亞群調(diào)控網(wǎng)絡的變化，作者利用Molecular Signatures Database(MsigDB)的hallmark基因集來分析相鄰正常組織和腫瘤組織之間MSCs、ECs、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、髓樣細胞、T細胞和B細胞通路的變化(圖2a)。與正常組織相比，腫瘤中的免疫相關通路（包括炎癥反應、IL2/STAT5信號和IL6/JAK/ STAT3信號）不僅在免疫細胞群(如髓樣細胞和T/ILC細胞)中豐富，在MSCs和ECs中也富集(圖2a)，這表明MSCs和ECs參與了結(jié)直腸癌的免疫應答。與正常樣本相比，腫瘤MSCs、ECs和髓樣細胞中缺氧相關的Hallmark基因被富集(圖2a)。這可能反映了腫瘤缺氧區(qū)的基質(zhì)細胞相互作用，將巨噬細胞、MSCs和ECs連接起來，重塑CRC微環(huán)境。此外，與正常組織相比，腫瘤髓樣細胞和T/ILC表現(xiàn)出更豐富的代謝相關基因(圖2a)，這表明免疫代謝在CRC TME中被重編程。綜上，這些發(fā)現(xiàn)表明CRC TME種主要細胞類型調(diào)控途徑的特異性。

由于作者的scRNA-seq數(shù)據(jù)集的樣本量有限，作者還分析了TCGA-COAD、TCGA-READ以及GEO數(shù)據(jù)庫中12個獨立CRC隊列的RNA-seq數(shù)據(jù)，使用CIBERSORTx分析免疫細胞的浸潤情況，分析結(jié)果表明在全部隊列中，MSC和髓樣細胞間存在顯著正相關（圖2b，c）。此外，作者還評估了CRC中MSC和髓樣細胞的浸潤程度與臨床表現(xiàn)的相關性（圖2d，e），結(jié)果表明MSC浸潤程度較高的CRC患者與較差的OS和PFS相關，髓樣細胞浸潤程度較高的CRC患者與較差的OS和PFS相關。

3．腫瘤特異性FAP+成纖維細胞與CRC進展相關。

長期以來，MSCs和成纖維細胞樣細胞被認為是調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生和癌癥進展的關鍵基質(zhì)細胞類型。作者使用之前報道的特異性細胞特征marker將MSCs分成10個亞型(圖3a)。與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中FAP+成纖維細胞、增殖成纖維細胞和周細胞明顯富集(圖3 b，c)。作者又進一步驗證TCGA-COAD隊列中的CRC患者FAP+成纖維細胞在腫瘤組織中的明顯富集（圖3d），同時還觀察到FAP+成纖維細胞浸潤程度較高的CRC患者PFS較短（圖3e）。此外，作者通過流式細胞術(shù)驗證了腫瘤特異性成纖維細胞的浸潤（圖3f、g），結(jié)果表明CRC腫瘤組織中FAP+成纖維細胞浸潤顯著增加，NT5E+和FGFR2+的浸潤顯著減少。

隨后，作者利用scRNA-seq數(shù)據(jù)預測FAP+成纖維細胞的分化軌跡，該分析預測腫瘤特異性FAP+成纖維細胞可能來源于FGFR2+成纖維細胞或ICAM1+特絡細胞（圖3h）。FAP+成纖維細胞的分化是通過復雜的轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors, TF）網(wǎng)絡調(diào)控的，作者分別評估了這10種MSC亞型top 5表達的TF以及TF調(diào)控網(wǎng)絡中top 5活性的調(diào)節(jié)子（圖3i-l），發(fā)現(xiàn)TWIST1在FAP+成纖維細胞的調(diào)控網(wǎng)絡中具有最高的表達和活性水平，并且可能代表驅(qū)動該分化途徑的主要TF。缺氧是TME最重要的特征之一，之前的研究表明TWIST1可能受缺氧的調(diào)控。與其他MSC亞類相比，缺氧依賴的HIF-1α信號途徑在FAP+成纖維細胞中顯著富集（圖3m）。

4．腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞與結(jié)直腸癌進展相關

CRC患者髓樣細胞的重塑表明這些細胞在腫瘤發(fā)生中具有功能。作者研究了在腫瘤組織和鄰近正常組織中髓樣細胞亞型的改變（圖4a），單細胞注釋將髓樣細胞分為9種亞類，巨噬細胞和中性粒細胞主要存在于腫瘤組織中，DC在鄰近正常組織中富集。重要的是，SPP1+巨噬細胞是腫瘤特異性巨噬細胞，在腫瘤樣本中占髓樣細胞的11.6%，但在鄰近正常組織中只占髓樣細胞的0.68%（圖4c）。作者又進一步驗證TCGA-COAD隊列中SPP1+巨噬細胞浸潤程度較高的CRC患者PFS較短（圖4e）。流式分析結(jié)果表明SPP1+巨噬細胞在腫瘤組織中的浸潤顯著增加，THBS1+巨噬細胞無明顯變化（圖4g）。此外，單細胞RNA?velocity預測結(jié)果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞可能起源于THBS1+巨噬細胞（圖4h）。為了進一步確定SPP1+巨噬細胞的主要調(diào)控因子，作者進行pySCENIC分析，結(jié)果表明編碼使小鼠巨噬細胞向M1表型極化的主轉(zhuǎn)錄因子STAT1在SPP1+巨噬細胞中高度活躍（圖4i-l）。由于FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞密切參與缺氧誘導途徑，作者推測在腫瘤的缺氧區(qū)域存在基質(zhì)細胞介導的網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡連接巨噬細胞和MSC，共同促進CRC微環(huán)境的惡化。

5．FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的高浸潤與較差的患者生存率相關。

作者使用CIBERSORTx評估了由scRNA-seq鑒定的50個細胞亞群在14個獨立的CRC隊列中的浸潤狀況（圖5a），發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的相關性最高。為了進一步揭示這兩種細胞類型之間密切相關的臨床意義，作者比較了不同水平FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的患者的PFS。FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞均高度浸潤的患者的PFS最短，表明這兩種細胞類型可以協(xié)同促進腫瘤進展（圖5b）。對TCGA-COAD隊列的GSEA分析表明，F(xiàn)AP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞均高度浸潤的腫瘤樣本中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化特征和缺氧基因集高度富集（圖5c），TNFα和IL2/STAT5信號通路也出現(xiàn)富集。這些發(fā)現(xiàn)表明FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞對CRC TME中不同的刺激和信號作出反應。隨后，作者通過對78例CRC患者組織芯片（TMA）的H-score系統(tǒng)評估蛋白表達水平，與鄰近正常組織相比，腫瘤組織中FAP和SPP1均增加（圖5d，e），F(xiàn)AP或SPP1蛋白表達水平高的患者OS較短（圖5f，g）。此外，F(xiàn)AP和SPP1表達水平均高的患者的存活率較低（圖5h）。免疫熒光標記表明CRC組織中SPP1陽性和FAP陽性的細胞空間距離非常接近（圖5I，j），這意味著這兩種細胞之間存在潛在的串擾。

6．空間轉(zhuǎn)錄組學揭示FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的細胞間相互作用

利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的空間組成進行更深入的評估（圖6a-f），結(jié)果顯示FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞共定位并包裹惡性上皮細胞（圖6g-i），F(xiàn)AP+成纖維細胞或SPP1+巨噬細胞的特征評分呈顯著正相關（圖6j、k）。此外，作者發(fā)現(xiàn)4例空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)形成相關的途徑高度活躍，包括細胞外基質(zhì)組織、膠原纖維組織和對TGF-β的反應（圖6l），T細胞和B細胞被排除在腫瘤區(qū)域外（圖6m）。這些結(jié)果表明，促結(jié)締組織增生的微環(huán)境可能受到FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的互作調(diào)控，限制免疫細胞對腫瘤核心的浸潤。

7．FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的相互作用可能對促結(jié)締組織增生腫瘤微環(huán)境的形成有促進作用

使用R包“NicheNet”對FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的細胞-細胞間通訊機制進行研究，作者發(fā)現(xiàn)FAP+成纖維細胞通過粘附配體受體對COL1A1/LAMA1-ITGB1與SPP1+巨噬細胞直接聯(lián)系（圖7a）。此外，F(xiàn)AP+成纖維細胞通過表達TGF-β超家族基因、TGFB1和INHBA增強SPP1+巨噬細胞的促炎活性，TGF-β誘導SPP1+巨噬細胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的（圖7a）。值得注意的是，F(xiàn)AP+成纖維細胞通過RARRES2-CMKLR1與SPP1+巨噬細胞相互作用（圖7a）。作者進一步確定了RARRES2在MSC群的相對表達，并發(fā)現(xiàn)該基因在FAP+成纖維細胞的表達水平高于其他MSC亞群（圖7b）。由RARRES2編碼的趨化素被證明是一個獨立的CRC風險因素，在DSS誘導的結(jié)腸炎模型中，趨化素能夠影響巨噬細胞的極化。編碼趨化素受體的基因CMKLR1在THBS1+巨噬細胞和SPP1+巨噬細胞中的表達水平較高（圖7c）。之前的RNA velocity預測結(jié)果表明腫瘤特異性SPP1+巨噬細胞可能起源于THBS1+巨噬細胞（圖4h），F(xiàn)AP+成纖維細胞可作為一個驅(qū)動因素，通過趨化素促進SPP1+巨噬細胞的分化。此外，作者發(fā)現(xiàn)CRC患者血漿中的趨化素水平顯著升高，提示趨化素可作為預測CRC的標志（圖7d）。

成纖維細胞是細胞外基質(zhì)成分的主要生產(chǎn)者，細胞外基質(zhì)成分可能有助于促結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)的形成。細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）相關通路的基因在FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞中高表達，表明FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞可能促進促結(jié)締組織增生結(jié)構(gòu)的形成。因此，作者研究了SPP1+巨噬細胞是否促進FAP+成纖維細胞的ECM重塑能力。NicheNet分析表明，SPP1+巨噬細胞表現(xiàn)出較高的TGFB1、IL1B和IL1A配體活性，TGFB1、IL1B和IL1A基因表達水平相對較高（圖7e，f）。此外，TGFB1編碼蛋白與FAP+成纖維細胞上編碼TGFBR3、ACVRL1和TGFBR1的受體結(jié)合，而編碼IL1B或IL1A的配體與FAP+成纖維細胞上編碼IL1R1或IL1RAP的受體相互作用（圖7g），導致編碼膠原或基質(zhì)金屬肽酶的靶基因在這些細胞中表達（圖7h）。這些靶點是促結(jié)締組織增生反應的重要組成部分，其中大部分參與ECM通路（圖7i, j）。綜上所述，研究結(jié)果表明FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞形成相互作用網(wǎng)絡，支持彼此的維持和功能。這兩種細胞類型可能在ECM重塑中發(fā)揮重要作用，可能促進TME促結(jié)締組織增生區(qū)域的形成。

8．FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的高浸潤與免疫治療耐藥相關

作者對FAP+成纖維細胞和/或SPP1+巨噬細胞不同浸潤模式的局部免疫特征進行分析，F(xiàn)AP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞浸潤程度高的腫瘤樣本表現(xiàn)出相對較高頻率的非沉默率突變和單核苷酸變異（SNV）預測的新抗原。此外，也表現(xiàn)出較高的香農(nóng)熵指數(shù)和TCR豐富度，反映了T細胞對新抗原的無效反應（圖8a-d）。這種亞型的CRC淋巴細胞浸潤程度最低（圖8e），表明該類型的CRC微環(huán)境特征是免疫排斥型的。使用IMvigor210公共數(shù)據(jù)集對經(jīng)抗PD-L1治療的膀胱癌患者的生存時間與FAP或SPP1表達進行相關性分析，PD-L1抗體治療后，F(xiàn)AP或SPP1表達水平較高的患者OS較短（圖8f, g），F(xiàn)AP和SPP1表達水平均較高的抗PD-L1治療患者OS較短（圖8h）。FAP或SPP1表達水平較高的患者表現(xiàn)出較低的應答和更多的疾病進展（progressive disease, PD），提示FAP或SPP1高表達的患者對抗PD-L1治療的應答明顯低于其他患者。

四、結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌存在多樣化的腫瘤微環(huán)境，其中FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞在腫瘤組織中富集。這項工作進一步強調(diào)了FAP+成纖維細胞和SPP1+巨噬細胞的浸潤是高度相關的，它們的存在與淋巴細胞浸潤呈負相關，預示著患者的生存率較差。免疫熒光染色和空間轉(zhuǎn)錄組學方法證實了這種相互作用，它們的共存與豐富的細胞外基質(zhì)表達有關，從而促進腫瘤結(jié)締組織結(jié)構(gòu)的形成。此外，FAP或SPP1的高表達有助于對PD-L1阻斷免疫治療產(chǎn)生耐藥性?？傊?，這項工作揭示了基質(zhì)細胞和巨噬細胞亞群之間復雜的相互作用，它們可以作為CRC免疫治療的潛在靶點。

參考文獻：

Qi, J., Sun, H., Zhang, Y. et al. Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer. Nat Commun 13, 1742 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29366-6

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