基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9被《科學(xué)》雜志列為2013年年度十大科技進(jìn)展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復(fù)序列的簡稱，Cas是CRISPR相關(guān)蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，是細(xì)菌用來識(shí)別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。

圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)。?

2018年11月26日，中國科學(xué)家賀建奎聲稱世界上首批經(jīng)過基因編輯的嬰兒---一對(duì)雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強(qiáng)大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對(duì)這對(duì)雙胞胎的一個(gè)基因進(jìn)行修改，使得她們出生后就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內(nèi)外網(wǎng)站上迅速發(fā)酵，引發(fā)千層浪。有部分科學(xué)家支持賀建奎的研究，但是更多的是質(zhì)疑，甚至是譴責(zé)。

即將過去的5月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發(fā)現(xiàn)呢？小編梳理了一下這個(gè)月的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

1.多項(xiàng)研究開發(fā)出可增強(qiáng)基因組編輯范圍的新型CRISPR/Cas9工具

doi:10.1038/s41467-020-16117-8; doi:10.1038/s41587-020-0517-0; doi:10.1126/sciadv.aau0766

CRISPR的應(yīng)用范圍從治療遺傳疾病到農(nóng)作物的營養(yǎng)功效，它已經(jīng)成為最有前景的基因組編輯工具之一。然而，Cas9酶依賴特定的DNA郵政編碼來確定切割和編輯的位置。雖然來自釀膿鏈球菌的Cas9（SpCas9）受到最廣泛使用，但是它需要靶位點(diǎn)旁邊存在兩個(gè)G堿基。只有不到10%的DNA序列符合這一要求。

在2020年5月發(fā)表在Nature Biotechnology期刊和NatureCommunications期刊上的兩項(xiàng)新的研究中，來自美國麻省理工學(xué)院等研究機(jī)構(gòu)的研究人員成功設(shè)計(jì)出具有增強(qiáng)基因組編輯能力的新蛋白，從而極大地拓寬了可以準(zhǔn)確有效地訪問的DNA序列。這兩項(xiàng)研究是由剛在麻省理工學(xué)院媒體實(shí)驗(yàn)室完成博士學(xué)位的Pranam Chatterjee、麻省理工學(xué)院媒體實(shí)驗(yàn)室副教授Joseph Jacobson與美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員合作完成的。論文標(biāo)題分別為“An engineered ScCas9 with broad PAM range and high specificity and activity”和“A Cas9 with PAM recognition for adenine dinucleotides”。

圖片來自Nature Communications, 2020, doi:10.1038/s41467-020-16117-8。

這些新發(fā)現(xiàn)源于這些作者早期在Cas9蛋白的計(jì)算發(fā)現(xiàn)方面取得的突破性成就。他們從犬鏈球菌（Streptococcus canis）中鑒定出了Cas9（ScCas9），并在實(shí)驗(yàn)中對(duì)它進(jìn)行了表征。雖然與SpCas9相似，但ScCas9具有更廣泛地靶向DNA序列的能力。這一發(fā)現(xiàn)將Cas9酶可以靶向的位置從最初的基因組上的10%位點(diǎn)擴(kuò)大到將近50%。2018年，他們?cè)赟cience Advances期刊上首次報(bào)道了這些發(fā)現(xiàn)（Science Advances, 24 Oct 2018, doi:10.1126/sciadv.aau0766）。

為了改進(jìn)ScCas9作為基因組編輯工具的功能，這些作者通過計(jì)算方法從相似的Cas9蛋白中找出了獨(dú)特的部分，從而設(shè)計(jì)出ScCas9的一個(gè)優(yōu)化版本，他們將它命名為Sc++。

與此同時(shí)，這些作者成功地利用他們之前開發(fā)的SPAMALOT算法，發(fā)現(xiàn)了需要兩個(gè)A堿基而不是兩個(gè)G堿基的獼猴鏈球菌（Streptococcus

macacae）Cas9（SmacCas9）。通過結(jié)構(gòu)域交換和進(jìn)一步的基因改造，他們獲得新的iSpyMac酶作為首批已知的不需要G堿基的Cas9編輯器之一，這樣就可以進(jìn)一步靶向之前無法靶向的20%的基因組。

鑒于世界各地的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始使用這些酶成功編輯從水稻到兔子等各種有機(jī)體的基因組，因此這兩項(xiàng)研究的下一個(gè)目標(biāo)將是開發(fā)工具來靶向剩余30%的基因組序列。Chatterjee與瑞士蘇黎世大學(xué)合作，正在尋求最終的進(jìn)展，從而讓科學(xué)家們能夠靶向任何基因組序列，并在治療遺傳疾病時(shí)解決任何類型的基因突變問題。

2.FDA批準(zhǔn)張鋒領(lǐng)銜開發(fā)的新冠病毒CRISPR測(cè)試：1小時(shí)出結(jié)果，如驗(yàn)孕紙般方便！

新聞來源：SHERLOCK-based one-step test provides rapid and sensitive COVID-19 detection

張鋒等人開發(fā)的基于CRISPR的新技術(shù)可以通過一步反應(yīng)在一小時(shí)內(nèi)提供SARS-CoV-2的檢測(cè)結(jié)果，研究人員共享了實(shí)驗(yàn)方案和工具包，以推進(jìn)研究并向臨床驗(yàn)證邁進(jìn)。美國FDA于5月6日批準(zhǔn)了該技術(shù)作為應(yīng)急測(cè)試用于臨床檢測(cè)新冠病毒。

來自麻省理工學(xué)院麥戈文大腦研究所、麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)的布羅德研究所、Ragon研究所和霍華德休斯醫(yī)學(xué)研究所的一組研究人員開發(fā)了一種新的診斷平臺(tái)，名為STOP (SHERLOCK Testing in One Pot)。該測(cè)試可以在一小時(shí)內(nèi)以最少的處理過程進(jìn)行單步反應(yīng)，這使得基于CRISPR的SHERLOCK診斷技術(shù)更接近于一種現(xiàn)場(chǎng)或家庭測(cè)試工具。它的工作原理是通過對(duì)CRISPR進(jìn)行編程，在鼻、口、喉拭子或肺部液體中檢測(cè)SARS-CoV-2基因物質(zhì)的片段。如果發(fā)現(xiàn)了病毒的遺傳物質(zhì)，CRISPR酶就會(huì)發(fā)出熒光。

這種新測(cè)試名為"STOPCovid"，基于STOP平臺(tái)。在研究中，它已被證明能夠快速、準(zhǔn)確和高度敏感地檢測(cè)COVID-19病毒SARS-CoV-2，方法很簡單，且只需要很少的培訓(xùn)，并使用簡單、現(xiàn)成的設(shè)備，如試管和水浴。STOPCovid已在研究中得到驗(yàn)證，研究人員使用了診斷為COVID-19的患者的鼻咽拭子。作為原理的證明，SARS-CoV-2 RNA被添加到唾液樣本中，然后用它進(jìn)行檢測(cè)也獲得了成功。

3.Nat Med重磅！基因編輯T細(xì)胞治療癌癥是安全的！華西醫(yī)院全球首個(gè)基因編輯T細(xì)胞治療癌癥的臨床試驗(yàn)結(jié)果公布！

doi:10.1038/s41591-020-0840-5

對(duì)免疫檢查點(diǎn)基因進(jìn)行CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯可以提高T細(xì)胞治療的療效，但首先必須了解其安全性和可行性。近日發(fā)表的利用CRISPR基因編輯技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的首次人體試驗(yàn)結(jié)果表明，這種療法是安全且持久的。

近日來自四川大學(xué)華西醫(yī)院的盧鈾教授領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì)在Nature Medicine上報(bào)告了全球首個(gè)基因編輯免疫細(xì)胞的臨床試驗(yàn)結(jié)果，該研究報(bào)道了CRISPR-Cas9介導(dǎo)PD-1編輯的T細(xì)胞在晚期非小細(xì)胞肺癌患者中的第一期臨床試驗(yàn)結(jié)果(ClinicalTrials.gov NCT02793856)。該研究的主要終點(diǎn)是安全性和可行性，次要終點(diǎn)是有效性。探索的目標(biāo)包括追蹤編輯過的T細(xì)胞。結(jié)果表明研究滿足了所有預(yù)先指定的終點(diǎn)。

研究人員從肺癌患者身上提取了T淋巴細(xì)胞，然后利用電穿孔介導(dǎo)的Cas9和單導(dǎo)RNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，使這些T細(xì)胞的PD-1失效，從而在體外制造PD-1編輯的T細(xì)胞。通常情況下，PD-1蛋白會(huì)發(fā)出信號(hào)，阻止免疫細(xì)胞對(duì)人體自身組織發(fā)起攻擊，而活躍的PD-1會(huì)打開癌癥擴(kuò)散的大門。

該研究共納入22例患者；其中17人獲得了足夠的編輯T細(xì)胞進(jìn)行輸注，12人能夠接受治療。研究人員發(fā)現(xiàn)所有與治療相關(guān)的不良事件均為1/2級(jí)。經(jīng)編輯的T細(xì)胞輸注后可在外周血中檢測(cè)到?；蚓庉嫼蟮腡細(xì)胞在血液中至少停留了4周，這表明這種策略可能會(huì)產(chǎn)生持久的效果。

這些病人的中位無進(jìn)展生存期為7.7周(95%置信區(qū)間，6.9 - 8.5周)，中位總生存期為42.6周(95%置信區(qū)間，10.3-74.9周)。研究人員通過對(duì)18個(gè)候選位點(diǎn)進(jìn)行下一代測(cè)序，發(fā)現(xiàn)脫靶事件的中位突變頻率為0.05%(范圍為0-0.25%)。

4.Nature：鑒別出新型T細(xì)胞免疫療法靶點(diǎn) 有望幫助開發(fā)抵御癌癥和自身免疫性疾病的新型療法

doi:10.1038/s41586-020-2246-4

近日，一項(xiàng)刊登在國際雜志Nature上題為“CRISPR screen in regulatory T cells reveals modulators of Foxp3”的研究報(bào)告中，來自加利福尼亞大學(xué)等機(jī)構(gòu)的科學(xué)家們通過研究表示，對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞進(jìn)行CRISRP篩選或有望揭示Foxp3分子的調(diào)節(jié)子，F(xiàn)oxp3是控制Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）發(fā)育和功能的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，它的是Treg免疫生物學(xué)重要的進(jìn)步，也為科學(xué)家們進(jìn)一步了解Treg功能和作用機(jī)制打開了一扇“門”。

圖片來源：Frontiers。

這項(xiàng)研究中，研究人員開發(fā)出了一種用于初級(jí)小鼠Treg細(xì)胞表型研究的基于CRISPR的聯(lián)合篩選平臺(tái)，同時(shí)研究人員利用該技術(shù)對(duì)大約500和核因子進(jìn)行了靶向功能缺失的篩選分析，從而識(shí)別出能促進(jìn)或干擾Foxp3表達(dá)的基因調(diào)節(jié)程序。研究者Jessica T. Cortez說道，我們發(fā)現(xiàn)了多個(gè)Foxp3表達(dá)的調(diào)節(jié)子，其中就包括泛素特異性肽酶22（Usp22）和環(huán)指蛋白20（Rnf20）；Usp22是SAGA染色質(zhì)修飾復(fù)合體去泛素化模塊的成員，其能作為一種正向調(diào)節(jié)因子來穩(wěn)定Foxp3的表達(dá)，然而，篩選結(jié)果表明，作為E3泛素連接酶，Rnf20能夠成為Foxp3的負(fù)向調(diào)節(jié)子。

研究者表示，在小鼠機(jī)體中對(duì)Usp22進(jìn)行Treg特異性地剔除或能降低Foxp3蛋白的水平并誘發(fā)其抑制性功能的缺失，從而導(dǎo)致自發(fā)性自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，但在多種癌癥模型中卻能保護(hù)機(jī)體抵御腫瘤的生長；在Usp22缺失的Treg細(xì)胞中，F(xiàn)oxp3的不穩(wěn)定或能被Rnf20的剔除來拯救，這就揭示了Treg細(xì)胞中或許存在一種相互的泛素化開關(guān)。

5.Nature重大突破：利用CRISPR實(shí)現(xiàn)病毒高通量檢測(cè)，一次檢測(cè)169種病毒！

doi:10.1038/s41586-020-2279-8

研究人員已經(jīng)開發(fā)出一種新技術(shù)，可以靈活地?cái)U(kuò)展基于CRISPR的分子診斷學(xué)，使用微流體芯片可以同時(shí)運(yùn)行數(shù)千個(gè)測(cè)試。單片芯片的能力范圍可以從一次在1000多個(gè)樣本中檢測(cè)一種單一類型的病毒，到在少量樣本中搜索160多種不同的病毒，包括COVID-19病毒。

這項(xiàng)技術(shù)被稱為核酸多重評(píng)估的組合排列反應(yīng)(Combinatorial Arrayed Reactions for Multiplexed Evaluation of Nucleic acids，CARMEN)，研究人員在病人樣本上進(jìn)行了驗(yàn)證，當(dāng)天就能得到結(jié)果，將來有一天可能會(huì)用于廣泛的公共衛(wèi)生工作。

這項(xiàng)研究成果發(fā)表在Nature雜志上，由麻省理工學(xué)院Broad研究所和哈佛大學(xué)博士后Cheri Ackerman和Cameron Myhrvold共同領(lǐng)導(dǎo)。Broad研究所核心成員、麻省理工學(xué)院生物工程系副教授Paul Blainey和哈佛大學(xué)教授、Broad研究所成員以及霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員Pardis Sabeti是這篇文章的共同通訊作者。

6.Disease Models & Mechanisms:研究揭示罕見病的遺傳機(jī)制

doi:10.1242/dmm.041913

在最近一項(xiàng)研究中，來自弗吉尼亞理工大學(xué)的研究者們通過遺傳學(xué)手段將一種罕見的人類疾病與PHETA1基因突變聯(lián)系起來。

通過在斑馬魚中使用CRISPR基因組編輯和其他研究工具，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)斑馬魚的PHETA1同源蛋白對(duì)于斑馬魚的腎功能和顱面發(fā)育至關(guān)重要。該研究發(fā)表在最新一期的《Disease Models and Mechanisms》上。