單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是精確理解生物體的生長和發(fā)育以及疾病的發(fā)生和發(fā)展所必需的。然而，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的研究仍處于起步階段，部分原因是單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)種類多、豐度低、數(shù)量少、不可擴(kuò)增性。基于質(zhì)譜（MS）的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在過去二十年中發(fā)展迅速，其特點(diǎn)包括樣品要求量低、靈敏度高、結(jié)構(gòu)信息豐富以及不需要使用抗體進(jìn)行標(biāo)記。電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)提供了最高的蛋白質(zhì)覆蓋率。然而，由于各種預(yù)處理方法、分離技術(shù)和MS儀器的可用性，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的樣品通量和覆蓋范圍可能有很大差異。

北京工業(yè)大學(xué)的汪夏燕教授團(tuán)隊(duì)根據(jù)用于分離單細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的不同方法對相關(guān)出版物進(jìn)行了分類，介紹了檢測覆蓋率和通量方面的不同方法，并強(qiáng)調(diào)了提供重大突破和進(jìn)步的技術(shù)；闡述了基于ESI-MS的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用和發(fā)展前景。

發(fā)表期刊：Trends in Analytical Chemistry

IF 14.908

發(fā)表時(shí)間：2022-12-31

發(fā)展歷程

傳統(tǒng)的群體細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法需要較大的樣本體積，通常為毫升（mL）量級。然而，大多數(shù)動物細(xì)胞的直徑為5-30um，單細(xì)胞體積為皮升（pL，10-12L）水平，為了便于MS檢測單細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，近年來基于ESI-MS的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法專注于減少樣品的處理量。

1：單細(xì)胞蛋白的初步檢測

Zhang等人在2015年提出了一種集成蛋白分析設(shè)備（iPAD），可以應(yīng)用于100個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)組分析（IPAD-100），乃至單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析（IPAD-1），單個(gè)HeLa細(xì)胞鑒定的蛋白質(zhì)總數(shù)為328，檢測限約為1.7-170zmol。

Fang等人提出了毫升級油氣滴（OAD）芯片，該方法樣品損失最小，樣品注入效率高（>99%），將該系統(tǒng)應(yīng)用于單個(gè)HeLa細(xì)胞，鑒定出51種蛋白質(zhì)；還使用該系統(tǒng)分析了單小鼠卵母細(xì)胞，并鑒定了355種蛋白質(zhì)。與傳統(tǒng)的管內(nèi)系統(tǒng)相比，該方法具有序列覆蓋率高、疏水蛋白和酶消化效率高的優(yōu)點(diǎn)。

Zhu和Kelly等人描述了一種基于納米微滴的處理平臺（nanoPOTS）（圖1），通過該設(shè)備捕獲芯片上的納米微滴中單個(gè)細(xì)胞并進(jìn)行裂解和蛋白消化。使用nanoLC-MS方法從單個(gè)CTC（LNCaP）細(xì)胞中總共檢測到167種蛋白質(zhì)。隨后，結(jié)合熒光激活細(xì)胞分選（FACS）用于將單個(gè)細(xì)胞沉積到納米液滴樣品處理芯片中，配適超靈敏納米LC-MS進(jìn)行分析，從單個(gè)HeLa細(xì)胞中鑒定出約670種蛋白質(zhì)（平均）。此外，來自酶解離的人肺原代細(xì)胞的細(xì)胞類型可以被區(qū)分，并且通過該單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)平臺鑒定了間充質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物。

通過最小化樣品預(yù)處理體積，開發(fā)了一種減少單細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品吸附的方法，以進(jìn)一步減少樣品的損失。Shi等開發(fā)了一種表面活性劑輔助的樣品制備方案（圖2）：SOP-MS方法將MS兼容的n-十二烷基-β-D麥芽糖苷與疏水表面基質(zhì)離心管或多孔板結(jié)合，用于樣品制備。該方法消除了所有樣品轉(zhuǎn)移步驟，并使有效單細(xì)胞處理的表面吸附損失最小化，從而提高了檢測靈敏度。實(shí)現(xiàn)了來自小組織切片（接近20個(gè)細(xì)胞）的1200個(gè)蛋白質(zhì)的無標(biāo)記定量；將該方法應(yīng)用于單細(xì)胞分辨率患者的CTC衍生異種移植物（PCDX）模型中，揭示了早期轉(zhuǎn)移肺細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞中不同的蛋白質(zhì)特征。

為了減少樣品吸附和損失，縮短處理時(shí)間，Kitamori等報(bào)告了一種集成的納米流體芯片裝置，用于在毫微微升（fL-pL）范圍內(nèi)操縱樣品以進(jìn)行高通量分析（圖3）。該裝置適用于胰蛋白酶水解、色譜分離和無標(biāo)記檢測，本研究使用了紫外檢測，預(yù)計(jì)ESI-MS與該裝置結(jié)合將在未來用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

2：提高單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的覆蓋率

進(jìn)一步提高單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的覆蓋，同時(shí)能夠量化蛋白質(zhì)，進(jìn)行了三個(gè)方面的研究，即(1)放大的蛋白質(zhì)信號；(2)增強(qiáng)分析柱的分離性能；(3)使用高靈敏度的MS。

Slavov等提出了單細(xì)胞SCoPE-MS方法，將來自單個(gè)細(xì)胞的TMT標(biāo)記載體蛋白與來自200個(gè)細(xì)胞的TMT-標(biāo)記載體蛋白混合來實(shí)現(xiàn)信號放大。該方法結(jié)果顯示了不同人類癌癥細(xì)胞類型的異質(zhì)性，并量化分化小鼠胚胎干細(xì)胞中的1000多個(gè)蛋白質(zhì)。于2021發(fā)布了SCoPE2（圖4），該方法改進(jìn)了樣品制備、數(shù)據(jù)采集和分析、不同TMT批次的整合，增加了分析的蛋白質(zhì)數(shù)量，提高了準(zhǔn)確性和通量。在10天內(nèi)對1490個(gè)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的3042個(gè)以上的蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量，定量的蛋白質(zhì)可用于按細(xì)胞類型識別單個(gè)細(xì)胞。

近年來，隨著單細(xì)胞蛋白質(zhì)信號放大策略的發(fā)展，色譜柱的分離性能和MS靈敏度得到了改善和提高。直徑幾十微米的填充色譜柱逐漸發(fā)展為直徑幾百納米至幾微米的開管色譜柱，稱為picoLC；Zhu和Kelly等在預(yù)處理過程中采用了高場非對稱離子遷移光譜法（FAIMS），配適超靈敏MS進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖5）。在無標(biāo)記條件下，單個(gè)細(xì)胞中鑒定出1000多種蛋白質(zhì)；Zhu和Kelly等人還將TMT信號放大策略與超靈敏納米LC-MS技術(shù)相結(jié)合，以量化單個(gè)細(xì)胞中的約1500個(gè)蛋白質(zhì)。Liu等人提出了一種結(jié)合皮升級液相色譜和質(zhì)譜（picoLC MS）的方法。picoLC柱的內(nèi)徑為2um，從僅75pg的胰蛋白酶肽中鑒定出約1000種蛋白質(zhì)，與當(dāng)前先進(jìn)的LC或CE-MS方法相比，靈敏度提高了10-100倍，這種超窄內(nèi)徑毛細(xì)管柱具有樣品消耗小和分離效率高的特點(diǎn)。因此，picoLC MS有望成為單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)的有力工具。

3：提高單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)檢測的通量

2008年，Audet等人提出了一種利用超聲剪切細(xì)胞并在細(xì)胞表面產(chǎn)生局部高壓超快裂解單細(xì)胞的方法，該技術(shù)平均需要50秒才能裂解單個(gè)細(xì)胞；當(dāng)細(xì)胞在超聲處理前用弱洗滌劑（如洋地黃苷）處理時(shí)，細(xì)胞裂解時(shí)間可縮短至3秒。Kitamori等人開發(fā)的集成納米流體芯片裝置發(fā)現(xiàn)，在納米通道中，12小時(shí)的大量消化色譜圖與15分鐘的消化色譜圖相似，表明兩種條件達(dá)到了相似的消化狀態(tài)。

Zhu和Kelly等人將微流體芯片平臺、單細(xì)胞自動分選和自動樣品注射結(jié)合到單細(xì)胞預(yù)處理過程中（圖6）以加快單細(xì)胞蛋白預(yù)處理速度。每個(gè)芯片允許快速分析243個(gè)單細(xì)胞。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)測量的靈敏度隨著低流量分離（<100nL/min）而提高，但樣品加載、柱清潔和再生所需的時(shí)間導(dǎo)致低通量和MS的低效利用，Kelly等人開發(fā)了雙柱液相色譜（LC）系統(tǒng)（圖7），該系統(tǒng)使用兩個(gè)并行子系統(tǒng)進(jìn)行樣品加載、在線脫鹽、分析和柱再生，從而大大提高了無標(biāo)記單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的產(chǎn)量。作為兩個(gè)柱交替處理的結(jié)果，高通量LC系統(tǒng)可重復(fù)使用。在單個(gè)HeLa細(xì)胞的分析中，當(dāng)周期為30min時(shí)，每個(gè)細(xì)胞中可鑒定出近1000個(gè)蛋白質(zhì)，當(dāng)周期時(shí)間為15min時(shí)，每細(xì)胞可鑒定出660個(gè)蛋白質(zhì)。

4：其他分離手段-毛細(xì)管電泳

單細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品也可以通過毛細(xì)管電泳（CE）分離。CE中通常使用兩種樣本采集方法，一種是從組織中分離單個(gè)細(xì)胞；另一種是使用移液管從單細(xì)胞微區(qū)吸取樣本。Sweedler等人建立了CE-TIMS MS方法，以探索單細(xì)胞水平上的肽立體化學(xué)（圖9），通過CE和MS對單個(gè)細(xì)胞的肽含量進(jìn)行了表征。

Nemes等人使用光學(xué)引導(dǎo)的原位亞細(xì)胞毛細(xì)管微取樣的方法對活脊椎動物胚胎進(jìn)行采樣，結(jié)合蛋白提取消化、毛細(xì)管分離肽、超靈敏納米電噴霧電離和高分辨率MS檢測，從5ng蛋白質(zhì)樣品中鑒定和定量了約750-800個(gè)蛋白質(zhì)（圖10）。

不過CE更適合分離大體積、蛋白質(zhì)含量更多的胚胎、卵母細(xì)胞或神經(jīng)元，與LC分離相比，分離效率低、重復(fù)性差，容易受到溫度和pH等影響，所以尚未在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。

總結(jié)

基于LC的分離方法可以在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組水平上實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的初步檢測。關(guān)于分離性能和優(yōu)化的MS參數(shù)、TMT標(biāo)記載體蛋白能夠使單細(xì)胞蛋白的檢測覆蓋率的極大增加；為了解決單細(xì)胞檢測過程中低通量的問題，可以使用微流體芯片、自動化設(shè)備和TMT標(biāo)記的組合來提高?；贚C的分離方法還存在一些缺點(diǎn)，主要包括預(yù)處理時(shí)間長、單細(xì)胞樣品稀釋和損失、低豐度蛋白質(zhì)分離和檢測不足等，因此該研究仍有很大的發(fā)展空間。