結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一。臨床上，近一半的CRC患者中發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，致使死亡率較高[1]。因此，迫切需要更有效的診療策略以及精準(zhǔn)醫(yī)療，在分子水平上分析結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機制。

環(huán)狀RNA(circRNAs)是一類新型的非編碼RNA，通過在5端和3端之間的共價連接形成閉環(huán)，circRNAs可以作為miRNAs海綿，與RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯[2]。鑒于circRNA的特點，其可能在某些疾病，特別是癌癥中發(fā)揮新型分子標(biāo)記的作用，實際上在不同類型的癌癥中都有報道，包括胃癌、乳腺癌、CRC和肝細胞癌等。

2023年1月，廣州南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院李婷婷教授在Cell Death & Disease發(fā)表文章：CircIFNGR2 enhances proliferation and migration of CRC and induces cetuximab resistance by indirectly targeting KRAS via sponging to MiR-30b。文章介紹，CRC是世界上最常見的惡性腫瘤，并顯示出西妥昔單抗耐藥性。而作者發(fā)現(xiàn)，circIFNGR2在轉(zhuǎn)錄后通過海綿miR-30b間接調(diào)控靶基因KRAS，誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞對西妥昔單抗的耐藥。本研究提示，抑制circIFNGR2可能是抑制惡性CRC患者西妥昔單耐藥的一種治療策略。

1、circIFNGR2在結(jié)直腸癌中表達上調(diào)?

首先作者試驗驗證，circIFNGR2是反向剪切形成。并且，與正常組織相比，CRC腫瘤組織circIFNGR2表達顯著升高；而CRC癌旁組織和CRC組織關(guān)于circIFNGR2的qPCR結(jié)果與此一致。

2、circIFNGR2正向調(diào)控CRC細胞的增殖、侵襲和遷移能力?

作者分別設(shè)計過表達和敲低circIFNGR2，無論是在離體的CRC細胞系中，還是在在體的小鼠模型中，驗證circIFNGR2對于CRC細胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，circIFNGR2在CRC細胞的增殖、侵襲和遷移能力中具有顯著的正向調(diào)控作用。

3、circIFNGR2海綿抑制miR-30b的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性??

作者使用starBase網(wǎng)站，預(yù)測circ_IFNGR2可以與miR-30b結(jié)合。隨后作者分別構(gòu)建野生型和突變型載體，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Ccirc_IFNGR2與miR-30b存在結(jié)合；FISH實驗結(jié)果也顯示circIFNGR2和miR-30b在細胞質(zhì)中明顯共定位。此外，RNA pulldown實驗證明，靶向circIFNGR2的生物素化探針可以同時下拉HCT8和CACO2細胞中的miR-30b。RIP結(jié)果顯示，在過表達miR-30b的細胞中，被anti-Ago2靶向miR-30b拉低的circIFNGR2顯著富集。上述實驗均證明，circIFNGR2與miR-30b的直接結(jié)合，并能夠反向調(diào)控miR-30b。

鑒于miR-30b在CRC中作為抑癌基因發(fā)揮作用，作者接下來進行了一系列細胞功能測定，以探索miR-30b是否可以逆轉(zhuǎn)circIFNGR2對CRC細胞功能的影響。正如預(yù)期的那樣，無論是在體實驗還是離體實驗，均證明，miR-30b對CRC細胞侵襲和增殖凋亡能力的影響同circIFNGR2相反，并且circIFNGR2的加入，能夠逆轉(zhuǎn)miR-30b對CRC細胞的作用。綜上所述，circIFNGR2可以通過靶向miR-30b在體內(nèi)和體外影響CRC細胞的功能。

4、circIFNGR2通過靶向miR-30b影響KRAS的表達?

KRAS可以通過激活下游AKT信號促進細胞增殖和抑制細胞凋亡。circIFNGR2可增加CRC細胞中KRAS的mRNA水平。Western blotting檢測相應(yīng)KRAS下游信號蛋白如p-ERK和p-AKT的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，circIFNGR2過表達促進p-ERK和p-AKT蛋白表達水平上調(diào)。此外，在WT-KRAS CRC患者中，circIFNGR2可上調(diào)KRAS的表達，激活下游AKT信號通路，促進CRC細胞對西妥昔單抗的耐藥。

作者進一步驗證了circIFNGR2、miR-30b和KRAS之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，內(nèi)源性miR-30b被靶向KRAS的生物素標(biāo)記探針拉低。在HCT8和CACO2細胞中進行的Anti-Ago2 RIP實驗顯示，抗ago2對miR-30b的抑制作用下，KRAS大量富集。提示miR-30b可下調(diào)KRAS的表達。然而，在CRC細胞中轉(zhuǎn)染circIFNGR2逆轉(zhuǎn)了KRAS的下調(diào)。相反，在circIFNGR2過表達組中，加入miR-30b則降低了KRAS的水平。綜上所述，雖然miR-30b可以下調(diào)KRAS的表達，但circIFNGR2可以逆轉(zhuǎn)miR-30b下調(diào)KRAS的作用。

5、circIFNGR2在CRC細胞中誘導(dǎo)西妥昔單抗治療耐藥?

西妥昔單抗可誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，從基因水平抑制細胞過程，也可與NK細胞等效應(yīng)細胞的Fc片段受體結(jié)合，通過抗體依賴細胞細胞毒性殺傷腫瘤細胞。

考慮到circIFNGR2有助于CRC中癌細胞的特性，作者接下來研究circIFNGR2是否導(dǎo)致西妥昔單抗治療耐藥。CCK8、transwell和集散形成實驗顯示circIFNGR2增強了CRC細胞的增殖和遷移能力。然而，西妥昔單抗治療后，對照CRC細胞的增殖和遷移能力下降，而circIFNGR2過表達的CRC細胞的增殖和遷移能力未下降。這提示，circIFNGR2過表達可促進西妥昔單抗化療耐藥性。CRC細胞創(chuàng)面愈合試驗的統(tǒng)計分析表明，西妥昔單抗處理后，未轉(zhuǎn)染circIFNGR2的細胞遷移能力明顯降低，而circIFNGR2過表達組細胞遷移能力無明顯影響；流式細胞儀檢測凋亡的結(jié)果也與此一致。體內(nèi)裸鼠異種實驗也進一步印證了circIFNGR2在西妥昔單抗耐藥中的作用。綜上所述，circIFNGR2通過靶向KRAS誘導(dǎo)CRC細胞對西妥昔單抗的耐藥。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41419-022-05536-8

參考文獻：

[1]?Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin.2020;70:7–30.

[2]?Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet.2019;20:675–91.

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