蛋白純化是指通過基因工程技術(shù)將編碼蛋白的核酸序列導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，使其大量表達(dá)，再使用適當(dāng)?shù)募兓椒▽⑵湓隗w外純化出來，從而獲得高純度、活性和產(chǎn)量的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可以分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)兩大類。

下面介紹在原核系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)并使用親和層析的方法體外純化蛋白的原理和方法。

原理

1、乳糖操縱子的負(fù)調(diào)控：在沒有乳糖存在時，lac操縱子處于阻遏狀態(tài)，此時，I序列表達(dá)Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄啟動。當(dāng)有乳糖存在時，乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘?，異乳糖結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離，從而啟動轉(zhuǎn)錄。

? 異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用與異乳糖相同，是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實驗室廣泛應(yīng)用。

2、宿主菌株的選擇：

（1）BL21是最常用于原核表達(dá)的菌株之一，主要適用于非毒性蛋白的表達(dá)，具有大腸桿菌聚合酶，故可適用于tac或trc等使用大腸桿菌RNA聚合酶的原核系統(tǒng)的表達(dá)（如：pGEX，pMAL質(zhì)粒）。

（2）BL21(DE3)在BL21菌株的染色體上整合了λ噬菌體DE3區(qū)的T7噬菌體RNA聚合酶基因，可同時表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的表達(dá)。

3、蛋白質(zhì)的純化方法：

（1）凝膠過濾層析：根據(jù)分子大小從混合物中分離蛋白質(zhì)，不同蛋白的形狀及分子大小存在差異，在混合物通過含有填充顆粒的凝膠過濾層析柱時，由于各種蛋白的分子大小不同，擴(kuò)散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內(nèi)的能力也各異，大的蛋白分子會被先洗脫出來，分子越小越晚洗脫。

（2）離子交換層析：依據(jù)蛋白表面所帶電荷量不同進(jìn)行蛋白分離純化，蛋白表面通常會均勻帶有一定的電荷，在一定條件下可以與陽/陰離子交換柱結(jié)合。在改變pH或者用逐漸增加離子強(qiáng)度的緩沖液洗脫時，結(jié)合的物質(zhì)可與洗脫液中的離子發(fā)生交換而被洗脫到溶液中。由于不同物質(zhì)的電荷不同，與離子交換柱的結(jié)合能力也不同，所以被洗脫到溶液中的順序也不同。

（3）疏水作用層析：利用蛋白質(zhì)的疏水性，蛋白經(jīng)變性處理或處于高鹽環(huán)境下疏水殘基會暴露于蛋白表面，不同蛋白疏水殘基與固定相的疏水性配體之間的作用強(qiáng)弱不同，依次用從高至低離子強(qiáng)度洗脫液可將疏水用作由弱至強(qiáng)的組分分離。

（4）親和層析：把待純化的某一蛋白質(zhì)（或在蛋白質(zhì)上加上標(biāo)簽）的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法共價連接到載體分子上，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物加到填有親和介質(zhì)的層析柱時，待純化的蛋白質(zhì)與配體特異性結(jié)合，而其他蛋白質(zhì)則不被結(jié)合，通過洗滌除去，被特異結(jié)合的蛋白質(zhì)可以用含游離的相應(yīng)配體溶液洗脫下來。

4、蛋白純化標(biāo)簽的選擇：

不同標(biāo)簽的特點(diǎn)如下↓

His標(biāo)簽純化：組氨酸標(biāo)記（His-tag）是最常用的標(biāo)簽之一，在蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端加上6~10 個組氨酸，在一般條件或變性條件（如8M 尿素）下借助它能與Ni2+螯合柱緊緊結(jié)合的能力，再用咪唑洗脫（競爭性地與珠孔內(nèi)的鎳離子介質(zhì)結(jié)合），使得目的蛋白被純化出來。

器材

實驗試劑：

IPTG；LB培養(yǎng)基；

Lysis buffer：20mM Tris (7.9)、500mM NaCl、10mM Imidazole；

Wash buffer：20mM Tris (7.9)、500mM NaCl、20mM Imidazole；

Elution buffer：20mM Tris (7.9)、200mM NaCl、300mM Imidazole（咪唑濃度可根據(jù)洗脫效率進(jìn)行調(diào)整）；

透析液：20mM Tris (7.9)、50mM NaCl、10%甘油；

考馬斯亮藍(lán)染液；脫色液

儀器：

Ni-NTA、超聲破碎儀、層析柱、濃縮管

步驟

1、構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒：目的基因PCR，載體酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑單克隆送測序；

2、將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）中，37℃培養(yǎng)過夜，挑單克隆小搖過夜；

3、小誘導(dǎo)摸索最佳誘導(dǎo)條件：將搖過夜的菌液1:1000接種到3mL LB中，37℃搖4-5h至菌液OD600=0.6-0.8，加入不同濃度IPTG（0.1-1mM），不同溫度下誘導(dǎo)，隨著溫度降低，誘導(dǎo)時間延長，如37 ℃ 誘導(dǎo)4-5h，30°C誘導(dǎo)6h-8h，16°C誘導(dǎo)16-20h，取不同誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的菌液，跑膠，考染，觀察誘導(dǎo)結(jié)果；（一般來說，IPTG濃度越低，誘導(dǎo)溫度越低，目的蛋白表達(dá)越慢，越利于蛋白質(zhì)的正確折疊從而增加其可溶性，減少包涵體的產(chǎn)生）；

4、找到最適誘導(dǎo)條件后，將菌液1:1000接種到2L的LB中，37℃搖至菌液OD600=0.6-0.8，吸出20μL菌液留待跑膠(1)，然后在預(yù)實驗得到的合適的誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，吸出20μL菌液留待跑膠(2)；

5、取出誘導(dǎo)后的菌液，4000g，4℃離心15min；

6、棄上清液，稱重，每克菌加入10mL Lysis buffer（1:100加蛋白酶抑制劑），重懸，冰上放置約30min；

7、壓力破碎：放掉高壓均質(zhì)儀中的酒精，用水沖兩遍，用Lysis buffer平衡一遍，加入菌液，加壓（壓力不要超過800kpa），菌液過三到五遍至透明不粘稠；

8、收集破碎后的菌液，12000g，4℃離心20min，將上清和沉淀分離，各留取20μL樣品(3)(4)待跑膠；

9、將2mL Ni-NTA加入純化柱，待乙醇濾過，用水沖洗，加入Lysis buffer平衡柱子；

10、用Lysis buffer將Ni-NTA重懸加入上清中，混勻，4℃搖床孵育2h；

11、將上清液4℃過柱，收集濾過液20μL(5)；

12、用5mL Wash buffer洗柱子3次，收集濾過液樣品20μL(6)；

13、加入1mL Elution buffer，孵育5min，收集洗脫液，重復(fù)5次，收集5mL洗脫液于同一管中，留取20μL樣品(7)；

14、將實驗過程中得到的各個蛋白樣品跑膠，考馬斯亮藍(lán)染色1h，脫色至背景藍(lán)色較淺，可見清晰蛋白條帶；

15、分析各個樣品的蛋白條帶情況，根據(jù)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)操作：若洗脫蛋白樣品中蛋白無雜帶或雜帶少且淺，可進(jìn)行透析與濃縮，若雜帶多則需要再次純化后進(jìn)行透析與濃縮。

16、透析：將樣品加入透析膜中，兩端夾緊，4℃透析過夜；

17、濃縮：根據(jù)樣品分子量大小選擇合適的濃縮管4℃低速濃縮，濃縮后測蛋白濃度，分裝標(biāo)記，在液氮中速凍，然后凍存于-80℃冰箱。

結(jié)果

下圖所示為GFP蛋白體外親和純化的考染圖，經(jīng)純化蛋白純度與濃度大大提高。