1，首先需要得到待克隆的基因的CDS序列，上游UTR約250bp，下游UTR約250bp。將上游250bp和CDS序列和下游250bp拼起來(lái)，ctrl+C復(fù)制。

2，打開Primer Premier 5軟件（自行激活），選擇DNA Sequence。

3，把序列粘貼到空白面板處，彈出的框框直接點(diǎn)OK。

4，再點(diǎn)Primer。

5，在彈出的框框中點(diǎn)search。

6，彈出這么一個(gè)框框，因?yàn)橛蒙舷掠胃?50bp的UTR作為正/反向引物設(shè)計(jì)，所以正向引物Sense Primer的位置是1到250。我的這個(gè)基因兩個(gè)UTR和CDS加起來(lái)的整體的長(zhǎng)度是1935bp，所以反向引物的位置是在1685到1935。最后一個(gè)是PCR產(chǎn)物的大小，我的CDS長(zhǎng)度是1353，所以就是1353到1953。

7，點(diǎn)OK，OK。又彈出這么一個(gè)框框。一般對(duì)前5個(gè)結(jié)果進(jìn)行挑選。

8，以第二個(gè)結(jié)果為例，點(diǎn)一下之后，回到這個(gè)框框中，點(diǎn)左邊的S，代表Sense正向，再點(diǎn)Edit Primers。

9，彈出這么的框框，可以看長(zhǎng)度，Tm值和GC含量，底下還能看引物是否有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物二聚體，錯(cuò)配?？梢栽谀莻€(gè)小框里自行調(diào)整序列，比如我喜歡長(zhǎng)一點(diǎn)的，我調(diào)整到19~25bp，前后都可以根據(jù)自己的序列進(jìn)行加減微調(diào)堿基，再點(diǎn)右邊的Analysis信息就會(huì)更新。三個(gè)只紅了一個(gè)錯(cuò)配，還行。那我就挑選這個(gè)序列作為正向引物了，選中復(fù)制粘貼就行。

10，接下來(lái)就是回到第8步，點(diǎn)A，代表Anti反向。一樣的操作。一對(duì)引物的Tm值和長(zhǎng)度要相近。復(fù)制粘貼這段序列就行，它會(huì)自行從5’端開始的。一定要把信息記錄好，將序列信息發(fā)給公司合成引物就行了。

11，公司送到引物后，就可以做PCR，一般是連T載，轉(zhuǎn)大腸桿菌，然后涂板挑點(diǎn)搖菌，菌落PCR出來(lái)單條帶就可以送樣雙端測(cè)序了。因?yàn)楣緶y(cè)序前后50bp都是不準(zhǔn)的，且單端測(cè)序只能測(cè)約800bp，這種方法可以確認(rèn)基因的全長(zhǎng)，尤其是基因的兩端，往后就可以設(shè)計(jì)含同源臂的引物再連接各種載體了。引物設(shè)計(jì)還可以用NCBI網(wǎng)站，具體教程百度即可。

12，再次感謝我漂亮的吳師姐~