最近看文獻，發(fā)現(xiàn)有的文章在組裝過程中同時依賴了BioNano圖譜和Hi-C技術來進行輔助組裝，學習一下BioNano技術。

BioNano圖譜也好，Hi-C也好，都是用來將Scaffold來錨定到染色體上，輔助組裝。那么先回顧一下在這兩個技術之前所用的方法。

1、傳統(tǒng)錨定方法

傳統(tǒng)的染色體錨定方法有基于物理圖譜和遺傳圖譜的兩種方式，前者主要是通過序列的重疊關系來確定Scaffolds在染色體上的位置信息，后者主要是利用減數(shù)分裂時期的姐妹染色單體聯(lián)會后的重組率來判斷Scaffolds在染色體的排序和方向。在實際操作過程中，傳統(tǒng)的錨定方法存在實驗難度大、成本高和實驗誤差大等問題。

2、基于染色質(zhì)構象捕獲技術的錨定方法

Hi-C技術的基本原理如下：首先對處于生命狀態(tài)的細胞使用交聯(lián)劑將染色質(zhì)固定，最常使用的交聯(lián)劑是甲醛；接著利用限制性內(nèi)切酶如Hind III酶切消化被固定的染色質(zhì)；隨后使用生物素標記的核苷酸填充黏性末端；在稀釋環(huán)境中進行平末端填平反應，以促進交聯(lián)的染色質(zhì)片段之間的連接；隨后使用超聲波對捕獲DNA片段進行打斷處理，最后將被生物素標記的DNA片段通過Illumina平臺進行測序，得到全基因組染色質(zhì)互作矩陣。將得到的DNA序列比對到參考基因組上，如果一對序列對應于不同位置的酶切片段，那么就認為這兩個片段之間有一次染色質(zhì)互作，從而能夠構建基因組中所有酶切片段之間互作頻率矩陣。

Hi-C技術產(chǎn)生的染色質(zhì)互作呈現(xiàn)出隨著距離增加而衰減的規(guī)律，也就是說染色體內(nèi)部的相互作用強于染色體之間的相互作用，同一染色體上距離較近的互作強于距離較遠的互作。正是基于這一規(guī)律，Hi-C技術可以用來錨定Scaffolds，同時可以指導Scaffolds在染色體上的排序和定向。參考Hi-C測序及測序數(shù)據(jù)特征

3、基于光學譜圖技術的錨定方法

光學圖譜技術最早由Schwartz等(1993)發(fā)明，近期BioNano Genomics公司推出的Irys光學圖譜系統(tǒng)，才真正使光學圖譜技術得到商業(yè)化應用(Lam et al.,2021)。Irys系統(tǒng)利用特定的限制性內(nèi)切酶和特殊的熒光標記對長達幾百kb的單鏈DNA分子進行成像，利用高質(zhì)量圖像使基因組結構通過酶切圖譜的形式展現(xiàn)。

光學圖譜的基本原理如下：

在大量細胞溶液中，DNA分子被隨機剪切成為500kb左右的片段，隨后通過微孔道DNA片段被拉伸，并且被附著到一個帶有正電荷的玻璃支架上，接著利用特定的限制性內(nèi)切酶在相應酶切位點進行切割DNA。將切割后的DNA分子用熒光染料染色后，在顯微鏡下拍照(圖a-d)。Irys系統(tǒng)特有的超長讀長可以輕松地跨越重復序列區(qū)域和一些包含復雜元件的DNA片段，這極大地簡化了基因組的組裝過程，提高基因組的組裝效率，并且也很好的解決拼接缺口問題。光學圖譜

(BioNano)沿著幾百kb的DNA分子產(chǎn)生小序列結構的物理圖譜(如限制酶識別位點) (Lam et al.,2021)，不僅可以對Scaffolds進行排序和確定方向，并且也可以進行基因組組裝質(zhì)量評估。光學圖譜(BioNano)初期主要應用于基因組較小的微生物基因組組裝領域，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛地應用在植物基因組組裝領域。

Bionano技術簡單來說，就是給分子加上熒光標記，然后拍照，所以最原始的下機數(shù)據(jù)就是TIFF格式，但是我們拿到的一般都是經(jīng)AutoDetect/IrysView 轉(zhuǎn)換過的BNX格式。

Bionano光學圖譜展現(xiàn)了天然DNA分子的真實景觀。利用SP DNA分離試劑盒獲得超長DNA分子，用直接標記染色法(DLS)進行無損熒光標記，通過納米微流控芯片將每一條DNA分子線性化展開，并進行高分辨率熒光成像，為基因組學下游應用提供原始DNA景觀。這一真實的基因組物理圖譜，為基因組組裝提供了染色體尺度的框架，并能高效檢測到大片段純合子和雜合子結構變異。

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白菜參考基因組升級與染色質(zhì)互作分析，張磊，2018.

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