一、酶切實驗實驗方法和原理酶切技術是采用了粘性末端連接時必須對目的DNA分子以及載體分子進行酶切對應的粘末端進行連接。

二，酶切實驗所需的材料和試劑：
瓊脂糖，水平電泳儀，微波爐或電爐，電泳儀，臺式高速離心機，恒溫水浴，紫外線透射儀，1.5×TBE緩沖溶液。 2. 6x電泳上樣緩沖液：0.25％溴酚藍，40％（w / v）蔗糖水溶液，在4°C下保存。
3.?溴化乙錠（EB溶液的母液）：配制EB溶液 10mg / ml，并將其存儲在用鋁箔或黑紙包裹的容器中。

三，酶切實驗的操作步驟：
1. DNA消化反應
①給ep管編號（最好為0.5ml），用微量移液管加入1μgDNA和2μl相應的核酸內切酶反應10x緩沖液，再加蒸餾水使總體積為19μl。將溶液在管中混合后，加入1μl酶溶液。用手指輕拂管壁以混合溶液。您也可以用微量離心機搖動它以將溶液濃縮在試管底部。此步驟是整個實驗成功或失敗的關鍵。有必要防止不正確的添加和遺漏。使用擴展核酸內切酶時，應將離開冰箱的時間減至最少，以避免活性降低。
②混合反應體系后，將eppendorf管放在適當的支架上（例如泡沫板上），并在37°C水浴中放置2-3小時以完成消化反應。
③在每個試管中加入2μl0.1mol / L EDTA（pH8.0），充分混合以終止反應，并保存在冰箱中以備后用。2. 制備DNA分子量標準：使用DNA長度為50kb的雙鏈DNA分子，商業(yè)溶液的濃度為0.5mg / ml，并且酶促水解反應如上所述。獲得了八個片段，分別具有23.1、9.4、6.6、4.4、2.3、2.0、0.56和0.12kb的長度。 EcoRI切割了1個DNA，得到6個片段，長度分別為21.2、7.4、5.8、5.6、4.9和2.5 kb。3. 制備瓊脂糖凝膠過程 ①取20ml 5×TBE緩沖溶液，加水至200ml，制備0.5×TBE緩沖溶液，備用。
②膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，放入200ml錐形瓶中，加50ml 0.5×TBE代替緩沖液，放入烤箱（或電爐）中加熱至瓊脂糖全部融化，取把它搖勻。這是0.8％的瓊脂糖凝膠溶液。在加熱過程中不時搖動，使附著在瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時蓋上密封膜以減少水的蒸發(fā)。
③橡膠板的準備：分開有機玻璃膠水箱，并用橡皮膏（寬度約1cm）將其密封。將密封的膠水箱放在水平支架上，插入樣品梳，并觀察到梳齒的下邊緣應與膠水箱的底面保持約1毫米的間隙。將溴化乙錠添加到冷卻至50-60℃的瓊脂糖凝膠中（EB溶液轉化的最終濃度為0.5μg/ ml（也可以不向凝膠中添加EB，而不必在電泳后使用0.5μg/ ml））EB溶液浸泡和染色）。用移液管吸取少量融化的瓊脂糖凝膠密封膠糊，并在瓊脂糖溶液固化后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠罐中，使膠形成均勻的膠層。澆注過程中的溫度不能太低，否則固化會不均勻，速度不能太快，否則很容易出現(xiàn)氣泡。凝膠完全固化后，拉出梳子，注意不要損壞梳子底部的凝膠，然后將0.5x TBE緩沖液添加到槽中，直到液位剛好在凝膠表面以下。由于邊緣效應，樣品池附近會出現(xiàn)一些隆起，防止緩沖液進入樣品池，因此請注意確保樣品池中要充滿緩沖液。4.樣品的添加流程：取10μl酶促水解溶液和2μl6X上樣溶液混合，小心地用微量移液器將其添加到樣品罐中。如果DNA含量低，可以按照上述比例增加樣品量，但是在將每個樣品添加到總體積后應更換吸頭，以防止相互污染。裝入樣品時要小心，以免損壞凝膠或樣品罐。刺破底部凝膠。5.電泳過程：添加樣品后，關閉電泳槽的蓋子并立即打開電源。控制電壓保持在60-80V，電流大于40mA。當溴酚藍帶移至距凝膠前部約2 cm處時，電泳停止。5.進行染色：電泳完成后，將無EB的凝膠板轉移到0.5μg/ ml EB溶液中，在室溫下染色20-25分鐘。6.拍照和進行觀察：在長波紫外燈下，在254nm波長下染色或加入EB后，觀察電泳膠板。 DNA的存在顯示出橙紅色熒光帶，可以用肉眼區(qū)分。在紫光下觀察時，在將近攝鏡頭和紅色濾光鏡添加到相機鏡頭后，將相機固定在相框上。使用全色膠片，光圈為5.6，曝光時間為10-120秒。 （根據熒光條的強度選擇）。 7. DNA分子量標準曲線的制備：在放大的電泳照片上，以樣品罐為起點，使用卡尺以厘米為單位測量EcoRI和HindⅢ消化的λDNA片段的遷移距離。使用核苷酸數的常用對數作為縱坐標，以遷移距離作為橫坐標，在方格紙上繪制一條連接點的平滑曲線，這是電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
8.?確定DNA消化片段的大?。涸诜糯蟮碾娪菊掌?，使用卡尺測量DNA樣品中每個片段的遷移距離。根據該值，進一步計算DNA分子量標準曲線上的對應對數值。分子量大?。ㄈ绻褂脝螌捣礁窦埿蕵藴是€，則可以根據遷移距離直接插入DNA片段的大?。?。遷移距離。
9.?確定DNA消化片段的序列：根據單次消化，兩次消化和多次消化的電泳分析結果，比較DNA消化片段大小的數據進行邏輯推理，然后確定分離順序和相對每個限制位點的位置。以核苷酸圖或直線圖的形式，它是DNA分子的定向核酸內切酶圖。

四、酶切實驗需要注意的事項：
1.?消化過程中添加的DNA溶液的體積不能太大，否則DNA溶液中的其他成分會干擾酶的反應。
2.?酶活性通常以酶單位（U）表示。酶單位的定義是：在最佳反應條件下，在一小時內將1 mg lDNA完全降解的酶的量為一個單位，但在許多實驗中制備的DNA不如lDNA容易。添加過量的酶是合適的到反應溶液中。除了成本方面的考慮，酶溶液中的微量雜質可能會干擾后續(xù)反應。
3.?市場上出售的酶通常濃度很高。為了經濟起見，可以預先使用酶反應緩沖液（1x）。此外，該酶通常存儲在50％的甘油中。在實驗中，反應溶液中的甘油濃度應控制在1/10以下，否則會影響酶的活性。
4.?觀察DNA與紫外線透射儀是分不開的，但是紫外線可以切割DNA分子。當從凝膠中回收DNA時，請嘗試改變發(fā)光時間，并使用長波長紫外燈（300-360nm）減少紫外光對脫氧核糖核酸的裂解。
5. EB是一種強誘變劑，具有中等毒性。在準備和使用過程中應戴手套，并且EB不應灑在桌子或地面上。任何經過EB污染的容器或物品都必須經過特殊處理或最佳處理后進行清潔。
6.?當EB過多時，凝膠污漬太深，DNA條帶不清晰，將凝膠加入蒸餾水中沖泡，然后在30分鐘后觀察。

五、酶切實驗所需的試劑清單：

序列產品名貨號

1.?1000ul藍吸頭FT-1000
2.?200ul黃吸頭FT-200
3.?AgaroseSF0014?9012-36-6
4.?溴酚藍SX0029115-39-9
5.?溴化乙錠SS19571239-45-8
6.?1.5ml離心管?F-EP015
7.?EDTA?WSH44880?65501-24-8