?????? 上一期干貨內(nèi)容介紹了染色質免疫共沉淀（ChIP）的原理及其應用和實驗步驟，從ChIP實驗操作層面看相對簡單，但是實驗耗時長，通常需要至少一周的時間完成一次實驗，過程繁瑣，每一步都很考驗實驗操作技術，所以看似簡單的實驗其實需要注意的事項很多。在這一期，小編整理了ChIP實驗中常見的問題，供大家參考學習，實驗前一定要先熟悉各項實驗細節(jié)。工欲善其事，必先利其器，下面我們一起來看下具體有哪些值得注意的問題吧。

1.?????? 注意設置對照組

（1）Input DNA組：超聲使染色質斷裂后，得到未進行IP且經(jīng)解交聯(lián)的DNA。Input DNA是檢查ChIP實驗效率的參照，所以Input DNA對照是必須要設置的。

??（2）陰性對照組：一般將IgG設置為陰性對照，即在ChIP樣本中加入IgG抗體。

??（3）陽性對照組：陽性對照一般使用已知與DNA序列結合且保守的蛋白抗體，例如H3組蛋白抗體或RNA pol II抗體。

2.?????? 甲醛交聯(lián)時間

不同實驗條件和細胞類型，進行甲醛交聯(lián)的時間不同，通常需要摸索優(yōu)化交聯(lián)時間。根據(jù)經(jīng)驗，一般使用1%的甲醛濃度進行交聯(lián)，室溫固定10-15分鐘。時間太短的話，交聯(lián)反應進行的不徹底，很多蛋白與DNA的結合不是很牢固，交聯(lián)時間太長的話，會導致后續(xù)超聲非常困難，而增加超聲時間或功率會破壞目的蛋白本身的結構，進而導致ChIP結果不理想。

3.?????? 細胞方面

ChIP實驗所用細胞數(shù)量過多，將直接導致甲醛交聯(lián)時間增加，切斷染色質的過程中易造成裂解的DNA片段超過1000 bp，這些片段極易丟失，進而導致實驗失敗。最佳的DNA片段長度是200bp-1000bp。相反，如果過細胞數(shù)量太少，切斷的DNA片段極可能小于100bp，或樣本量不足。實驗細胞用量多少合適，最好進行預實驗摸索。

另一方面，保持細胞狀態(tài)良好，避免更多的因素影響細胞中蛋白與染色質的結合。

4.?????? 目標蛋白抗體

ChIP實驗首選用ChIP級抗體，是實驗成功的關鍵因素。ChIP級抗體識別的蛋白表位與WB和一般IP實驗是有區(qū)別的，并且能夠耐受高鹽、低鹽及多種去垢劑的洗滌。如果目標蛋白沒有對應特異性抗體可用，除了定制抗體外，還可以給目標蛋白融合標簽，通過標簽蛋白檢測目標蛋白。

5.?????? 為什么有的ChIP要使用酶消化？有的也可以用超聲破碎？

在N-ChIP中必須要使用核酸酶消化，因為蛋白不交聯(lián)DNA，并且與超聲處理碎裂有關的苛刻條件會導致染色質蛋白與DNA解離。而在X-ChIP中，酶消化或超聲都可以用于切斷染色質。與酶消化的染色質碎裂不同，超聲處理依靠機械力來將染色質碎裂成更小的片段?？墒谷旧|片段大小介于200-1000bp之間，這也是免疫沉淀的最佳染色質片段大小。

6.?????? ChIP超聲時注意事項有哪些？

（1）超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產(chǎn)生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產(chǎn)生氣泡。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。不同細胞超聲條件不同，超聲條件需自己摸索。

（2）若超聲時出現(xiàn)泡沫，立即停止超聲，至于冰上。之后用冷凍離心機高速離心1分鐘去除泡沫，繼續(xù)超聲。

7.?????? 哪些步驟時，可暫停實驗？

（1）細胞經(jīng)“交聯(lián)和收集細胞”步驟后，細胞可凍存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

（2）染色質斷裂后（超聲法或酶消化法），離心并轉移的上清染色質，可凍存-80℃?zhèn)溆谩?/p>

（3）染色質解交聯(lián)后（DNA回收純化前），可凍存于-20℃?zhèn)溆?。DNA回收純化后，可凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

以上則是一些ChIP實驗常見的問題啦，希望能對大家的實驗有幫助。下期將繼續(xù)介紹免疫沉淀相關的技術—RIP，感興趣的小伙伴可以關注下~漢恒專注病毒包裝十余載，如有技術問題或產(chǎn)品訂購需求，歡迎隨時咨詢！