如何培養(yǎng)PDO？一網(wǎng)打盡類器官前沿實驗方法，提升科研競爭力！
類器官轉化技術是一種多功能工具，能夠在體外生成和長期維持接近原生的3D上皮組織。通過原發(fā)性患者腫瘤組織生成的癌癥類器官，可以測試多種治療藥物的反應。因此，患者來源的癌癥類器官對個性化醫(yī)療有很大的前景。
今天小學社將與大家繼續(xù)深入討論類器官的世界了解更多類器官培養(yǎng)方面的技術和方法。分享大名鼎鼎的Hans Clevers教授在Nature Protocols雜志上發(fā)表的關于患者源類器官培養(yǎng)和藥敏實驗的文章。
癌癥是一種嚴重的疾病，常規(guī)治療方法如化療、放療和手術并不總是有效。因此，有必要開發(fā)新的治療方法以提高治療效果和生存率?；颊邅碓吹陌┌Y類器官（PDO）是一種新興的治療策略，可以更好地模擬患者的生理環(huán)境，從而更準確地評估藥物的療效和毒副作用。本研究介紹了建立癌癥類器官的詳細方案，包括從患者來源的組織中提取細胞、培養(yǎng)類器官和進行藥物篩選等步驟。這些方案可用于建立多種類型的類器官，如結直腸癌、膀胱癌等，并可應用于個性化醫(yī)療，為患者提供更優(yōu)化的治療方案。
1. PDO培養(yǎng)基本流程
A. 獲得組織：組織類型主要是三種：正常組織、腫瘤組織和活檢組織。
B. 處理樣本：剔除非上皮組織（脂肪和肌肉組織）后，進行消化解離。
C. 加入培養(yǎng)基：接種到3D基質(zhì)膠中，加入含有生長因子的培養(yǎng)基，通常包括：
Wnt信號通路激活劑；
酪氨酸受體激酶的配體（刺激上皮細胞增殖）；
TGF-β信號通路抑制劑（抑制上皮細胞分化）；
ROCK抑制劑（保持干細胞多能性）
D. 觀察形成的PDO
E. 進行傳代和藥敏試驗
2. 舉例詳細展示
研究人員在文章中以口腔粘液瘤為例進行了詳細展示，首先取到組織，去除脂肪和肌肉組織后，用胰酶消化，每隔十分鐘振蕩重懸，解離時間不超過60分鐘，然后用大量的培養(yǎng)基重懸，過100μm孔徑的細胞篩，未消化完全的部分留在了細胞篩上方，用培養(yǎng)基清洗以去除胰酶，然后離心，用冷BME重懸，迅速滴注點板，BME膠凝固之后添加培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在第0、3、7天觀察PDO的生長情況。
3. 頭頸鱗癌（HNSCC）PDO培養(yǎng)詳細步驟說明
研究人員將HNSCC的PDO培養(yǎng)做了一個長達89個步驟的建立過程，具體內(nèi)容及需要注意的關鍵點如下：
組織收集和處理（步驟1-5）
最好選用呈現(xiàn)粉紅色的活性高的組織塊，在運輸途中使用含有ROCKi Y27632的4℃培養(yǎng)基可以更好地保存。
從原代組織中建立產(chǎn)生類器官（步驟6-16）
分為以下幾步：
1）把組織切成小塊；
2）用各種酶消化成單細胞，比如膠原酶，胰酶，透明質(zhì)酸酶等；
3）把細胞與基質(zhì)膠混合后，以液滴的形式接種；
4）加入生長培養(yǎng)基培養(yǎng)。
不同種類的腫瘤PDO培養(yǎng)效率存在差異，頭頸部鱗癌(HNSCC)約為70%，乳腺癌約為60%，結直腸癌約為90%。為了提高成功率，建議在第1-2代細胞培養(yǎng)期間，在培養(yǎng)基中添加10uM的Y27632。在開始的幾天要密切觀察是否有細菌和真菌的污染，如果發(fā)現(xiàn)污染，請在受影響的培養(yǎng)孔中加入5M的NaOH處理1小時，然后清洗污染的孔，用酒精進行處理，最后更換蓋子。使用抗生素是必要的，并且要確保不受支原體污染。
類器官的傳代和傳代比例（步驟17-25）
如果使用TrypLE進行消化的話，要確保不要過度消化，每5分鐘使用顯微鏡觀察一次消化程度。如果觀察到有纖維狀或葡萄狀的形態(tài)，需要使用機械力對其進行剪碎處理。
類器官的凍存和復蘇（步驟26-42）
為了最大限度地提高高度增殖期類器官的復蘇效率，常規(guī)做法是在傳代后2-3天進行凍存。凍存單個細胞或已分化的大型類器官會導致復蘇效率下降。建議在用于藥物篩選之前至少培養(yǎng)一代經(jīng)過凍存的類器官。
類器官藥篩實驗的準備（步驟43-50）
為藥篩實驗分配類器官（步驟51-57）
在進行藥物篩選實驗之前，可以使用Dispase來消化基質(zhì)膠。隨后進行洗滌和過濾，以去除較大的器官類群，這些器官類群可能會對實驗結果產(chǎn)生較大的變異。
用感興趣的治療手段處理類器官（步驟58-74）
在基礎醫(yī)學科研中，設置陽性和陰性對照以及進行重復實驗非常重要。對于化療藥物，可以通過各種移液工作站輕松進行操作。同樣地，對于放療實驗，很方便地可以嘗試多種不同的放射劑量。
藥篩結果和數(shù)據(jù)分析（步驟75-88）
藥篩結果解讀
成功建立PDO（器官樣體）與所用組織標本的質(zhì)量息息相關，新鮮且富含上皮組織的樣本更容易培養(yǎng)出PDO。因此，在實驗初期，務必做好樣本處理工作，將樣本保存在4℃的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并添加10μM的Y-27632，以更好地維持細胞的活性。
本文來源：類器官學社
