論文名稱：A Useful SNP Panel to Distinguish Two Cockle Species, Cerastoderma edule and C. glaucum, Co-Occurring in Some European Beds, and Their Putative Hybrids

發(fā)表期刊：Genes

影響因子：3.331

涉及的歐易生物服務(wù)產(chǎn)品：2b-RAD

?研究背景?

蛤是非常珍貴的軟體動物，在歐洲有兩種不容易被區(qū)分的貝類，一種是可食用的Cerastoderma edule(以下簡稱C. edule)，另一種是不可食用的Cerastoderma glaucum(以下簡稱C. glaucum)。它們對寄生蟲Martelia cochillia表現(xiàn)出不同的抗性，C. edule對這種寄生蟲十分敏感，而C. glaucum似乎具有抵抗力。雖然潛在的原因尚不清楚，但是，通過自然或人工的方式，利用雜交完成基因滲入，使可食用的C. edule獲得對Martelia cochillia的抵抗力，并研究這種雜交物種的生存與繁殖是很有意義的。

Cerastoderma edule ?圖片來源：guiamarina.com

研究內(nèi)容

C. edule和C. glaucum很難一眼就分辨出來，尤其是在它們還小的時候。但是通過對它們形態(tài)特征的研究和積累的經(jīng)驗，還是可以區(qū)分的。首先對16個分布廣泛的采集點進(jìn)行190個純種樣品的采集，然后對其中150個樣品，使用2b-RAD篩選出9個SNP；其次使用SNaPshot進(jìn)行驗證，獲得7個SNP；最后再用SNaPshot方法檢測兩個物種是否為雜交物種。雖然這些雜交物種被證明是假陽性，但我們不能排除雜交可能發(fā)生和可行的事實；并且，文章中篩選出7個SNP來區(qū)別C. edule和C. glaucum，建立了區(qū)分這兩種貝類及其雜交種的SNP面板。對研究marteiliosis的抗性也有重要幫助。? ??

?研究結(jié)果?

1. 采用2b-RAD技術(shù)

利用2b-RAD技術(shù)對2017-2018年收集的30個C. glaucum個體和120個C. edule個體進(jìn)行基因分型，采用IIb限制性內(nèi)切酶AlfI，Illumina 測序平臺進(jìn)行測序。按質(zhì)量值(Phred值> 30)進(jìn)行過濾，使用Stacks 2.0進(jìn)行比對。最終獲得了9個SNP位點。

2.?采用SNaPshot篩選對選定的SNP進(jìn)行驗證

該方法基于兩步擴(kuò)增反應(yīng)方案對SNP進(jìn)行熒光檢測。第一步是對包含所選SNP的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增(使用外部引物)，第二步是對相鄰SNP引物(即內(nèi)部引物)進(jìn)行堿基測序反應(yīng),內(nèi)部引物設(shè)計長度差異通過在3 '末端添加CAGT序列來進(jìn)行測序。

根據(jù)上一步篩選出的SNP位點上、下游150 bp的基因組序列，利用Primer3軟件設(shè)計外部引物。Amplitaq GoldTM DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，只選擇在瓊脂糖凝膠中條帶大小符合要求并單一完整的樣品在ABI 3730xl 中進(jìn)行檢測，內(nèi)部引物可用于基因分型。這些序列使用BLASTn默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行注釋。最終篩選出7個SNP位點。

3. 疑似雜交物種的鑒定

選46個樣品（包括31個純合C. edule，5個純合C. glaucum，10個疑似的雜交物種）進(jìn)行SNaPshot驗證，結(jié)果與ITS方法相反，全部為純合子。雖然這些雜交物種被證明是假陽性，但我們不能排除雜交可能發(fā)生的事實。

?研究結(jié)論?

1. 經(jīng)過質(zhì)量過濾，平均每個標(biāo)本保留2768161條reads。兩個物種共識別了13715個SNP, 2057個診斷型位點和11,658個限制型位點。在限制型位點中，1658例為C. edule(1190例的MAF≥0.05;占71.8%)，10,000例為C. glaucum(3028例的MAF≥0.05;占30.3%)。這些研究表明，C. glaucum的遺傳多樣性遠(yuǎn)高于C. edule。

2. 作者用他們開發(fā)的PANL鑒定了10個可能的雜交個體，結(jié)果卻是純合的，并且在9個SNP位點上都是純合的，但是以前的ITS工具鑒定這些個體是雜交個體，所以得出了矛盾的結(jié)果。雖然這些雜交物種被證明是假陽性，但我們不能排除雜交可能發(fā)生的事實。

3. 使用兩種技術(shù)(即2b-RAD和SNaPshot)分析的個體中獲得的基因型是相同的。這9個標(biāo)記的序列證實，這些標(biāo)記在兩個物種之間具有單一的診斷差異(GenBank登錄號:MN178488-MN178496)。最終開發(fā)出了針對這個品種的7個位點的特異分子標(biāo)記，構(gòu)建了PANL，為之后的研究提供了方法思路。

?青島歐易 2b-RAD簡化基因組測序

技術(shù)簡介

2b-RAD技術(shù)使用IIB型限制性核酸內(nèi)切酶（如BsaXI）對基因組DNA進(jìn)行酶切，切割位點位于識別位點的左右兩側(cè)，酶切后產(chǎn)生等長的33 bp的標(biāo)簽，這些標(biāo)簽經(jīng)過富集后用于高通量測序，通過生物信息學(xué)分析實現(xiàn)全基因組范圍高通量SNP篩查和分型分析。

2b-RAD技術(shù)流程

技術(shù)特點

1. 適用于降解樣品、痕量樣品（ng級DNA）；

2. 技術(shù)重復(fù)性好，標(biāo)簽長度一致、測序深度均一，SNP準(zhǔn)確性和利用率高。

IIB型內(nèi)切酶酶切標(biāo)簽圖解

（“紅色堿基”為酶切識別位點，左右兩側(cè)切割產(chǎn)生粘性末端，切割位點與識別位點的相對距離是固定的，基因組各位置切下來的標(biāo)簽等長）

青島歐易

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青島歐易 撰文

本文系青島歐易原創(chuàng)

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