一、傳代培養(yǎng)概念

當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會(huì)出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁細(xì)胞會(huì)在培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)成致密單層 (懸浮細(xì)胞會(huì)充滿整個(gè)體積的培養(yǎng)液)，鋪滿培養(yǎng)瓶底部，此時(shí)如果不及時(shí)進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸走向衰老、死亡，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。

二、常見(jiàn)的細(xì)胞類型：

貼壁細(xì)胞：該類細(xì)胞的生長(zhǎng)必須有可以貼附的支持物表面，細(xì)胞依靠自身分泌的或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長(zhǎng)，繁殖；當(dāng)細(xì)胞在該表面生長(zhǎng)后，一般形成兩種形態(tài)，即成纖維樣細(xì)胞性或上皮樣細(xì)胞；其生長(zhǎng)過(guò)程分為游離期、貼壁期、潛伏期、對(duì)數(shù)期、平臺(tái)期和衰退期。

懸浮細(xì)胞（suspension cell ）：不貼附于生長(zhǎng)物，細(xì)胞呈圓形，呈單個(gè)細(xì)胞或者細(xì)小細(xì)胞團(tuán)，懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)空間大，傳代方便，能夠大量增殖。

因此，細(xì)胞的傳代培養(yǎng)也被分為兩類

1、貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

加培養(yǎng)液終止消化后加入步驟——1000rpm離心3min——離心——新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞——隨后進(jìn)行——計(jì)數(shù)——最后分裝

詳細(xì)步驟如下：

① 首先倒掉培養(yǎng)基，在這一步驟可以收集一些細(xì)胞上清做支原體檢測(cè)

② 加入胰蛋白酶，一般T25是＋2mL，蓋好瓶蓋，搖晃T25培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶均勻覆蓋在細(xì)胞表面，放入培養(yǎng)箱2-3min，期間可在顯微鏡下觀察，看到大部分細(xì)胞變圓，即可放入超凈臺(tái)，加入2倍的完全培養(yǎng)基，這里就是加4mL培養(yǎng)基，終止消化

③ 將含有胰蛋白酶，細(xì)胞和培養(yǎng)基一起轉(zhuǎn)移到離心管中，1000rpm/3min離心，去掉上清

④ 新鮮的完全培養(yǎng)基重懸，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行傳代，比如我養(yǎng)的Hepa1-6就長(zhǎng)的比較快，不是著急用的話，我就會(huì)按1E6個(gè)細(xì)胞/T75培養(yǎng)瓶進(jìn)行傳代；但如果后兩天要用，就會(huì)適當(dāng)多傳一點(diǎn)

⑤ 還可通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)后，直接用于細(xì)胞鋪板，繼續(xù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)

2、懸浮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

① 離心全換液法：通過(guò)離心（800-1000rpm，5min）去除全部舊的培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基；該方法適合“皮實(shí)“好養(yǎng)的懸浮細(xì)胞換液(如K562)，或當(dāng)前細(xì)胞狀態(tài)良好、密度較高導(dǎo)致培養(yǎng)基消耗較大的情況；換液徹底，能去除部分細(xì)胞碎片，但會(huì)對(duì)細(xì)胞造成一定程度的機(jī)械損傷

② 離心半換液法：通過(guò)離心（800-1000rpm，5min）50%細(xì)胞懸液，更換50%體積的新鮮培養(yǎng)基。該方法適合比較“矯情“難養(yǎng)的細(xì)胞（如THP-1），或正在調(diào)整狀態(tài)中、密度較低但碎片較多需要去除的情況

③ 沉降換液法：利用重力自然沉降，將培養(yǎng)基與細(xì)胞分離，達(dá)到全部或部分更換為新鮮培養(yǎng)基；只適合能成一定大小細(xì)胞團(tuán)（否則無(wú)法自然沉降，只能低速離心）的細(xì)胞，尤其是處理依賴細(xì)胞聚集才能增殖的細(xì)胞，如NK-92、Jurkat；可最大限度避免離心過(guò)程造成的機(jī)械損傷，同時(shí)保留聚集的細(xì)胞團(tuán)

三、細(xì)胞傳代注意事

① 細(xì)胞操作的所有過(guò)程都需遵守?zé)o菌操作；

② 細(xì)胞長(zhǎng)到85-90%左右就可以考慮傳代

③ 細(xì)胞重懸時(shí)，盡量吹散，尤其是容易結(jié)團(tuán)的細(xì)胞，比如HepG2細(xì)胞，結(jié)團(tuán)率過(guò)高影響細(xì)胞的活率和生長(zhǎng)

④ 不管是貼壁/懸浮細(xì)胞，吹打時(shí)動(dòng)作輕柔，避免產(chǎn)生氣泡

⑤ 每次移液后需及時(shí)更換槍頭，避免造成溶液交叉污染

⑥ 貼壁細(xì)胞用胰酶消化時(shí)，需嚴(yán)格控制消化時(shí)間

⑦ 選擇適合的傳代比例，保證細(xì)胞在使用時(shí)是處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)

⑧ 盡量使用一次性無(wú)菌移液管，減少污染的風(fēng)險(xiǎn)

附：