人結直腸癌類器官培養(yǎng)攻略
?原代培養(yǎng)
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一、準備工作
1、儀器設備
CO2 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺、倒置顯微鏡、臺式冷凍離心機、水浴鍋（abs72023）或水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。
2、試劑耗材
人結直腸癌類器官培養(yǎng)基試劑盒（abs9445）、基質膠（低因子、無酚紅）（abs9495）、60mm細胞培養(yǎng)皿（abs7005）、100μm濾篩（abs7009）、15ml離心管（abs7102）、1.5ml EP管若干（abs7119）、24孔細胞培養(yǎng)板（abs7058）、金屬冰盒、眼科剪刀、眼科鑷。
試劑盒組成
組分名稱
二、操作流程
1、類器官操作流程——樣本準備
1）將組織放入含有預冷的（2-8°C）組織保存液 E的取樣瓶中（浸沒整個組織），4℃從醫(yī)院/實驗室取回。
2）將取樣瓶消毒，組織取出放入培養(yǎng)皿樣本拍照，并登記，大小，顏色，軟硬程度，組織類型等信息。
2、類器官操作流程——清洗、剪碎
在60mm細胞培養(yǎng)皿（abs7005）里用2-3ml原代培養(yǎng)緩沖液 B浸泡。用原代培養(yǎng)緩沖液 B清洗三次（每次更換培養(yǎng)皿）后剪碎，剪成大約1-3mm3的組織塊，靜置2次。
3、類器官操作流程——消化、過濾
1）向EP管中加入適量人結直腸癌原代組織消化液 C（消化液是組織體積的3-5倍）在37℃進行消化10-15min（消化過程中隨時觀察消化情況）。
2）取少量液體在顯微鏡下觀察，鏡下觀察到較多的單個細胞或 70um 以下的細胞簇后， 加入3倍體積原代培養(yǎng)緩沖液 B?終止消化，用槍頭輕柔吹打可以看到液體變渾濁。
3）使用100μm濾篩（abs7009）進行過濾，取少量濾液在鏡下進行觀察。將濾液收集到15ml離心管，于300g 4℃ 富集離心5min后移去上清（清洗一次），添加1ml左右原代培養(yǎng)緩沖液 B轉移到1.5mlEP管，重新重懸離心（清洗二次）。
4、類器官操作流程——離心、加膠
基質膠計算：第3步后觀察收集到的組織體積，添加25倍組織體積的基質膠（abs9495）重懸鋪板（金屬冰盒或冰上操作）。
5、類器官操作流程——點膠、加液
以24孔細胞培養(yǎng)板為例，每孔點膠25ul組織基質膠混合物進行鋪板（金屬冰盒或冰上操作），將鋪好的培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加500-750μl?小鼠正常肝類器官培養(yǎng)基 A（恢復室溫）進行培養(yǎng)。
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6、類器官操作流程——觀察
?傳代培養(yǎng)
一、類器官傳代培養(yǎng)——樣本收集
1、移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加?1-2ml左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。
2、移液搶輕柔吹打基質膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min（每 6-8 孔為一組） 。
?二、類器官傳代培養(yǎng)——樣本消化
1、類器官數量不足或體積較小時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g4℃ 離心 5min（如圖5）棄去液體進行第3步。
2、類器官數量較多或體積較大時：300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加適量類器官傳代消化液 D（是類器官懸液的1-2倍）超凈臺內消化?2-3min（中間可以吹打1-2次）（如圖6）?，添加適量類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G（緩沖液G：傳代消化液D=5:1）終止消化，300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml（ 如圖7） 離心管，300g 4℃ 離心 5min 棄去液體進行第3步。（如圖4）
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?三、類器官傳代培養(yǎng)——鋪板
類器官收集后，添加25倍基質膠重懸（基質膠體積：細胞沉淀體積=25:1），每孔25μl（如圖8） 基質膠鋪在 24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min?添加 500μl-750ul（如圖9）人結直腸癌類器官培養(yǎng)基 A。
?四、類器官傳代后增殖現象
??類器官凍存
?1、移液器吸去培養(yǎng)基，每孔添加?1-2ml?左右4℃類器官傳代培養(yǎng)緩沖液G放置 2min。
2、移液搶輕柔吹打基質膠，收集在 15ml 離心管中，4℃靜置 10min(每 6-8 孔為一組) 。
3、300g 4℃ 離心 5min 棄去上清，添加1ml類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸移入 1.5ml 離心管，300g4℃ 離心 5min 棄去液體。
4、添加適量類器官凍存液 F，輕柔吹打重懸，以24孔細胞培養(yǎng)板為例：密度為2個孔凍存 1管（500個/ml密度凍存），每管體積1.4ml。
5、凍存方法
1）將凍存管放入梯度凍存盒然后保存至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
2）4℃冰箱放置30 min，轉移至-20℃放置1 h，最后移至-80℃過夜，第二天取出放入液氮罐。
?類器官復蘇
1、實驗前準備
1）將水浴鍋預熱至37℃；
2）細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用預防噴霧噴涂并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面；
3）在超凈工作臺中按次序擺好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)板等。
?2、取出凍存管
1）根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
2）從液氮罐中取出凍存盒，取出所需的凍存管，同時核對凍存管外的編號。
3、迅速解凍
迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍，并要不斷地搖動，使管中的液體迅速融化。約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管地外壁，再拿入超凈臺內。
4、將類器官組織液移入15ml離心管，添加類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G?10ml重懸，輕柔吹打混勻，300g 4℃ 離心 5min。
5、棄上清，添加1ml?類器官傳代培養(yǎng)緩沖液 G重懸將沉淀轉移至1.5ml?EP管，300g 4℃ 離心 5min，棄去上清。
6、添加25倍基質膠（abs9495）重懸（基質膠體積：細胞沉淀體積=25:1），每孔25μl基質膠鋪在 24孔細胞培養(yǎng)板中，放置培養(yǎng)箱中 10-15min 添加 500μl-750ul?人結直腸癌類器官培養(yǎng)基 A。
?類器官鑒定
一、類器官鑒定——類器官收集
1、類器官收集；
2、清洗1-3遍，洗去大部分基質膠，離心棄去大部分上清。
二、類器官鑒定——瓊脂糖凹槽制備
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三、類器官鑒定——固定
四、類器官鑒定——包埋
五、類器官鑒定——HE染色
?六、類器官鑒定——HE染色結果（以肺癌為例）
