一、原理

凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

⒈凝膠的選擇根據實驗目的不同選擇不同型號的凝膠。如果實驗目的是將樣品中的大分子物質和小分子物質分開，由于它們在分配系數上有顯著差異，這種分離又稱組別分離，一般可選用SephadexG-25和G-50，對于小肽和低分子量的物質（1000-5000）的脫鹽可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果實驗目的是將樣品中一些分子量比較近似的物質進行分離，這種分離又叫分級分離。一般選用排阻限度略大于樣品中最高分子量物質的凝膠，層析過程中這些物質都能不同程度地深入到凝膠內部，由于Kd不同，最后得到分離。

⒉柱的直徑與長度根據經驗，組別分離時，大多采用2-30cm長的層析柱，分級分離時，一般需要100cm左右長的層析柱，其直徑在1-5cm范圍內，小于1cm產生管壁效應，大于5cm則稀釋現象嚴重。長度L與直徑D的比值L/D一般宜在7-10之間，但對移動慢的物質宜在30-40之間。

⒊凝膠柱的制備凝膠型號選定后，將干膠顆粒懸浮于5-10倍量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹，溶脹之后將極細的小顆粒傾瀉出去。自然溶脹費時較長，加熱可使溶脹加速，即在沸水浴中將濕凝膠漿逐漸升溫至近沸，1-2小時即可達到凝膠的充分脹溶。加熱法既可節(jié)省時間又可消毒。

凝膠的裝填：將層析柱與地面垂直固定在架子上，下端流出口用夾子夾緊，柱頂可安裝一個帶有攪拌裝置的較大容器，柱內充滿洗脫液，將凝膠調成較稀薄的漿頭液盛于柱頂的容器中，然后在微微地攪拌下使凝膠下沉于柱內，這樣凝膠粒水平上升，直到所需高度為止，拆除柱頂裝置，用相應的濾紙片輕輕蓋在凝膠床表面。稍放置一段時間，再開始流動平衡，流速應低于層析時所需的流速。在平衡過程中逐漸增加到層析的流速，千萬不能超過最終流速。平衡凝膠床過夜，使用前要檢查層析床是否均勻，有無“紋路”或氣泡，或加一些有色物質來觀察色帶的移動，如帶狹窄、均勻平整說明層析柱的性能良好，色帶出現歪曲、散亂、變寬時必須重新裝柱。

⒋加樣和洗脫凝膠床經過平衡后，在床頂部留下數亳升洗脫液使凝膠床飽和，再用滴管加入樣品。一般樣品體積不大于凝膠總床體積的5%-10%。樣品濃度與分配系數無關，故樣品濃度可以提高，但分子量較大的物質，溶液的粘度將隨濃度增加而增大，使分子運動受限，故樣品與洗脫液的相對粘度不得超過1.5-2.樣品加入后打開流出口，使樣品滲入凝膠床內，當樣品液面恰與凝膠床表面相平時，再加入數毫升洗脫液中洗管壁，使其全部進入凝膠床后，將層析床與洗脫液貯瓶及收集器相連，預先設計好流速，然后分部收集洗脫液，并對每一餾份做定性、定量測定。

⒌凝膠柱的重復使用、凝膠回收與保存一次裝柱后可以反復使用，不必特殊處理，并不影響分離效果。為了防止凝膠染菌，可在一次層析后加入0.02%的疊氮鈉，在下次層析前應將抑菌劑除去，以免干擾洗脫液的測定。

二、材料和耗材

1.器材：層析柱、恒流泵、自動部分收集器、紫外檢測器、記錄儀、量筒、燒杯、試管、吸管、玻璃棒等。

2.試劑

??（1）牛血清

??（2）洗脫液：0.9% NaCl溶液

三、實驗步驟

1. 凝膠的前處理（如果是濕膠，此步略過）

將Sephadex G-75置燒杯中，加入洗脫液于室溫溶脹2～3天，反復傾瀉去掉細顆粒，然后減壓抽氣去除凝膠孔隙中的空氣，沸水浴中煮沸2～3小時（可去除顆粒內部的空氣及滅菌）。在凝膠溶脹時避免劇烈攪拌，以防凝膠交聯(lián)結構的破壞。

2. 裝柱

取潔凈的的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。在柱中注入洗脫液（約1/3柱床高度），將凝膠濃漿液（1:1稀釋）緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1～2cm 高度后打開出水口，使凝膠沉降，并不斷加入凝膠濃漿。注意裝柱過程中注意凝膠不能分層。

3. 平衡

裝柱完成后，接上恒流泵，以0.9%的氯化鈉為流動相，以0.75ml/min(Φ1.6cm柱)或0.5ml/min(Φ1.0cm柱)的速度開始洗脫，用5倍床體積的洗脫液平衡，使柱床穩(wěn)定。在出口處測定流速以便后續(xù)準確確定收集體積。

4. 凝膠柱總體積（Vt）的測定。

平衡完畢后，測定凝膠柱床的高度，計算柱床總體積Vt（凝膠柱直徑為1 cm或1.6cm）。

5. V0的測定（此步可略過）

打開出水口，使殘余液體降至與膠面相切（但不要干膠），關閉出水口。用細滴管吸取0.2ml（4mg/ml）藍色葡聚糖-2000，小心地繞柱壁一圈（距膠面2mm）緩慢加入，打開出水口（開始收集?。?，等溶液滲入膠床后，關閉出水口，用少許洗脫液沖洗2次，待滲入膠床后，再在柱上端加滿洗脫液，開始洗脫，作出洗脫曲線。收集并量出從加樣開始至洗脫液中藍色葡聚糖濃度最高點（肉眼觀察）的洗脫液體積即為V0。

藍色葡聚糖洗下來之后，還要用洗脫液繼續(xù)平衡１～２倍床體積（實驗中平衡1hr），以備下步實驗使用。

6. 上樣、洗脫?

將柱中多余的液體放出，使液面剛好蓋過凝膠，關閉出口。用移液管吸取0.5mL（柱床體積約25 mL）蛋白質混合液小心地加到凝膠床上，打開出水口，待樣品完全進入凝膠后，加少量洗脫液沖洗柱內壁2次，待液體完全流進床內后，關閉出水口。在柱上端加滿洗脫液，打開恒流泵，開始洗脫收集，4~6 min一管（約3?mL）。用紫外分光光度計監(jiān)測各管收集液的OD280值，軟件以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪出洗脫曲線。在色譜峰對應的收集管上做好標記，用于SDS-PAGE。

7. 凝膠柱的后處理（由于放置時間過久將失效，可不做回收處理）

一般凝膠柱用過后，反復用蒸餾水（2～3倍床體積）通過柱即可。如若凝膠有顏色或比較臟，需用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗滌，再用蒸餾水洗。冬季一般放2個月無長霉情況，但在夏季如果不用，需要加0.02%的疊氮化鈉防腐。

8.?蛋白濃度測定

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四、結果

五、思考題

1.?利用凝膠層析法分離混合樣品時，怎樣才能得到較好的分離效果？

?1.裝柱時要注意凝膠的流速，不宜過快，同時要保證凝膠能充分的沉淀且分布的比較均勻。
2.凝膠溶脹所用的溶液應與洗脫用的溶液相同，否則由于更換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化而影響分離效果。
3.樣品的濃度和加樣量的多少。是影響分離效果的重要因素。樣品濃度應適當大，但大分子物質的濃度大時，溶液的黏度也隨之變大，會影響分離效果，要兼顧濃度與黏度兩方面。加樣量和加樣體積越少分離效果越好，加樣量一般為柱床體積的1%-2%，制備用量一般為柱床體積的20%-30%。

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