寫(xiě)在前面

????????今天推薦的是由中國(guó)臺(tái)灣國(guó)立衛(wèi)生研究院免疫學(xué)研究中心團(tuán)隊(duì)在2020年1月8日發(fā)表于Cancers（IF：6.1265，JCR 2區(qū)）的一篇文章，通訊作者是Tsung-Hsien Chuang教授，研究表明Snail1對(duì)Ubiquitin特異性蛋白酶4的表觀(guān)遺傳學(xué)沉默有助于巨噬細(xì)胞依賴(lài)性炎癥和肺癌的治療抗性。

研究背景

????????泛素化是一種多步驟的轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程，其中單泛素或多泛素鏈附著在底物蛋白上。泛素鏈可以通過(guò)不同位置的賴(lài)氨酸殘基與靶蛋白相連。另一方面，泛素化過(guò)程可以被去泛素化酶 (DUB) 逆轉(zhuǎn)，該酶將泛素從底物蛋白上切割下來(lái)。人類(lèi)基因組中編碼了大約100個(gè)DUB。根據(jù)靶蛋白和泛素化類(lèi)型，單個(gè)DUB可以是特定信號(hào)通路的正調(diào)節(jié)器或負(fù)調(diào)節(jié)器這些 DUB對(duì)維持多種細(xì)胞功能至關(guān)重要，DUB的失調(diào)可導(dǎo)致多種臨床疾病

摘要部分

????????在這項(xiàng)研究中，作者分析了去泛素酶（DUBs）的表達(dá)與OncoLnc數(shù)據(jù)庫(kù)中的生存數(shù)據(jù)的相關(guān)性。在所分析的DUBs中，泛素特異性蛋白酶4（USP4）的負(fù)Cox系數(shù)最低。USP4的低表達(dá)與肺癌患者的生存率低有關(guān)，并與干性和炎癥標(biāo)志物的表達(dá)成反比。在肺癌的晚期，USP4的表達(dá)量減少。在機(jī)制上，USP4的表達(dá)在snail1高表達(dá)和干性富集的肺癌細(xì)胞中被下調(diào)。Snail1通過(guò)與巨噬細(xì)胞相互作用在肺癌細(xì)胞中被誘導(dǎo)，并通過(guò)啟動(dòng)子甲基化從表觀(guān)上抑制USP4的表達(dá)。肺癌細(xì)胞中USP4的穩(wěn)定敲低增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)、干性特性、化療抗性，以及允許逃避免疫監(jiān)視的分子的表達(dá)。此外，注射了USP4敲低的肺癌細(xì)胞的小鼠顯示出腫瘤發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的增強(qiáng)。這些結(jié)果顯示，Snail1介導(dǎo)的對(duì)USP4的抑制是協(xié)調(diào)表觀(guān)遺傳調(diào)節(jié)、炎癥和巨噬細(xì)胞促進(jìn)的腫瘤進(jìn)展的一個(gè)潛在機(jī)制。

研究?jī)?nèi)容

1.肺癌中USP4的下調(diào)與預(yù)后不良以及炎癥標(biāo)志物的高表達(dá)有關(guān)? ? ?

????????為了確定可能有助于肺癌發(fā)展或抑制的DUBs，作者在OncoLnc中搜索了測(cè)得DUB表達(dá)的肺腺癌患者的生存數(shù)據(jù)。通過(guò)該搜索檢索到72個(gè)DUBs的Cox系數(shù)，其中USP4的負(fù)Cox系數(shù)最高。這種負(fù)相關(guān)關(guān)系表明，USP4的表達(dá)對(duì)肺癌患者的生存是有益的。另一方面，與高表達(dá)亞組相比，低表達(dá)亞組的總生存期更短，表明USP4低表達(dá)與肺癌預(yù)后差有關(guān)。OncoLnc數(shù)據(jù)還分析了USP4的表達(dá)水平與各種炎癥和干性標(biāo)志物之間的相關(guān)性。USP4的低表達(dá)與促炎癥細(xì)胞因子IL-8的高表達(dá)以及干性標(biāo)志物Sox2、ALDH1和CD117的上調(diào)有關(guān)。

????????通過(guò)qPCR檢測(cè)正常和不同癌癥階段組織中USP4的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與正常人的肺組織相比，II期至IV期的肺癌組織中USP4的表達(dá)水平明顯降低。通過(guò)分析Oncomine的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步研究了USP4在各種正常和癌癥組織類(lèi)型中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與匹配的正常組織相比，USP4在多種頭頸部、乳腺癌和肺癌中的表達(dá)較低。

研究結(jié)論：USP4的表達(dá)與干性標(biāo)志物、炎癥標(biāo)志物和肺癌預(yù)后的呈反比例關(guān)系。

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2.高細(xì)胞干性的癌細(xì)胞中USP4的下調(diào)情況

????????通過(guò)RT-qPCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析表明，幾種肺癌細(xì)胞系的球體細(xì)胞中USP4的表達(dá)低于親代細(xì)胞。然后比較親代D121和LLC細(xì)胞與相應(yīng)球體形成細(xì)胞RT-qPCR的USP4和不同干性相關(guān)基因的表達(dá)水平，表明球體細(xì)胞中干性相關(guān)基因Oct4、Sox2、ALDH1、ABCG2和Snail1的表達(dá)水平增加，而USP4的表達(dá)與親代細(xì)胞相比則降低。

研究結(jié)論：USP4的表達(dá)水平與不同的干性標(biāo)志物之間存在反比例關(guān)系，干性越強(qiáng)USP4表達(dá)越低。

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3.Snail1促進(jìn)USP4啟動(dòng)子的DNA甲基化并抑制USP4的表達(dá)? ? ?

????????在這些干性相關(guān)基因中，已知Snail1通過(guò)與啟動(dòng)子E-box圖案5'-CANNTG-3'結(jié)合并協(xié)調(diào)CpG島高甲基化的活動(dòng)，在表觀(guān)遺傳學(xué)抑制基因表達(dá)方面發(fā)揮作用。因此，作者研究了Snail1是否也對(duì)肺癌細(xì)胞中USP4的表達(dá)減少有貢獻(xiàn)。為了研究Snail1是否真的能結(jié)合并調(diào)節(jié)USP4啟動(dòng)子，作者生成了熒光素酶報(bào)告構(gòu)建體，對(duì)生成的熒光素酶活性的分析表明，Snail1的表達(dá)抑制了USP4啟動(dòng)子的活性，而且E-box I和E-box IV都是Snail1在USP4啟動(dòng)子上的活性所必需的。使用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR調(diào)查了八個(gè)CpG-核苷酸的甲基化狀態(tài)。相對(duì)于對(duì)照組H1299細(xì)胞，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Snail1的細(xì)胞表現(xiàn)出這些CpG-核苷酸的更大的DNA甲基化。

????????隨后，作者評(píng)估了Snail1對(duì)USP4 mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。與USP4啟動(dòng)子高甲基化的表觀(guān)遺傳抑制相一致，Snail1在D121、LLC和H1299細(xì)胞中的過(guò)量表達(dá)降低了USP4在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

研究結(jié)論：Snail1促進(jìn)USP4啟動(dòng)子的DNA甲基化并抑制USP4的表達(dá)。

????????通過(guò)OncoLnc分析進(jìn)一步研究了Snail1和USP4在肺癌中表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Snail1高表達(dá)和USP4低表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)。在USP4低（底部50%）和USP4高（頂部50%）的肺癌亞組中，Snail1的表達(dá)也有明顯差異。另一方面，與低表達(dá)亞組相比，高Snail1表達(dá)亞組在前3000天的生存期更短，表明USP4低表達(dá)與肺癌預(yù)后差有關(guān)。

????????此外，利用UALCAN程序?qū)?dòng)子DNA甲基化狀態(tài)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肺腫瘤中USP4啟動(dòng)子的甲基化程度明顯高于正常肺組織。

研究結(jié)論：USP4的表達(dá)與Snail1和USP4啟動(dòng)子的甲基化在肺癌中呈反比關(guān)系。

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4.巨噬細(xì)胞促進(jìn)了肺癌細(xì)胞中Snail1的表達(dá)和USP4的下調(diào)??? ?

????????作者研究了巨噬細(xì)胞是否調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞中Snail1的表達(dá)。將LLC肺癌系與骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞（BMDMs）共同培養(yǎng)在雙室跨孔板中，并通過(guò)RT-qPCR和流式細(xì)胞儀分析與LLC單培養(yǎng)物相比的基因表達(dá)情況。這些比較顯示，共培養(yǎng)的LCCs表達(dá)更多的細(xì)胞干性標(biāo)志物（Oct4和Sox2），以及表達(dá)表面干性標(biāo)志物CD117的比例更大。此外，這些變化與炎癥細(xì)胞因子TNF-、IL-1、IL-6和IL-8的表達(dá)水平增加有關(guān)。RT-qPCR和免疫印跡法顯示，巨噬細(xì)胞的存在增強(qiáng)了Snail1的表達(dá)，減少了USP4在LCC細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平的表達(dá)。

????????另一方面，與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的結(jié)果一致，TNF-和IL-1處理使D121和H1299細(xì)胞系的USP4下調(diào)，Snail1上調(diào)，這一點(diǎn)通過(guò)免疫印跡分析得到證明。

研究結(jié)論：巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥、干性和Snail1的表達(dá)，并下調(diào)肺癌細(xì)胞的USP4。

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5.USP4的下調(diào)增加了癌細(xì)胞促炎癥因子的表達(dá)

????????作者隨后研究了USP4在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞炎癥狀態(tài)方面的功能。眾所周知，IL-8的表達(dá)受NF-κB激活的控制。數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示，USP4和IL-8的表達(dá)水平呈反比關(guān)系，表明USP4可能對(duì)癌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)。

????????為了研究這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染USP4靶向shRNA，敲低了D121、LLC和H1299肺癌細(xì)胞中USP4的表達(dá)。在所有的癌癥細(xì)胞系中，敲低USP4增加了NF-κB的內(nèi)在激活。此外，USP4的敲低還增強(qiáng)了NF-κB控制的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的基礎(chǔ)表達(dá)水平，以及TNF-α和TLR配體對(duì)這些細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。用NF-κB抑制劑BMS345541處理細(xì)胞時(shí)，TNF-α的細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力和USP4敲低的增強(qiáng)效果被阻斷。

研究結(jié)論：USP4是癌細(xì)胞炎癥狀態(tài)的一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)器。

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6.USP4的下調(diào)促進(jìn)了癌癥細(xì)胞的干性和治療抗性? ? ?

????????根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，USP4的表達(dá)與肺癌中干性標(biāo)志物的表達(dá)呈反比關(guān)系。此外，USP4基因在癌細(xì)胞的干性富集過(guò)程中被下調(diào)，這一點(diǎn)從球體形成試驗(yàn)中得到了證明。因此，作者調(diào)查了USP4是否直接調(diào)控干性。事實(shí)上，敲低癌細(xì)胞系中的USP4，通過(guò)RT-qPCR測(cè)量，不同細(xì)胞系的干性基因Oct4、Sox2、Nanog、KLF4、ABCG2和ALDH1的表達(dá)有不同程度的增加。使用細(xì)胞增殖進(jìn)一步研究了USP4下調(diào)對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響。

????????作者進(jìn)一步調(diào)查了USP4在肺癌細(xì)胞中的下調(diào)是否會(huì)賦予化療和免疫療法抗性。與這一概念一致，USP4敲低的LLC和H1299細(xì)胞對(duì)順鉑和阿霉素處理48小時(shí)的細(xì)胞毒作用比相應(yīng)的對(duì)照細(xì)胞更有抵抗力。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，LLC和H1299細(xì)胞在USP4敲低后都表現(xiàn)出更多的PD-L1表面表達(dá)（PD-L1，腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視的關(guān)鍵蛋白）。此外，用NF-B抑制劑BMS345541處理后，PD-L1的表達(dá)也減少了。這些結(jié)果表明，USP4的下調(diào)會(huì)增強(qiáng)化療抵抗力，并幫助肺癌細(xì)胞逃避抗腫瘤免疫的破壞。

研究結(jié)論：USP4敲低會(huì)增加肺癌細(xì)胞的干性、轉(zhuǎn)化能力和治療阻力。

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7.USP4的下調(diào)促進(jìn)小鼠的腫瘤發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)

????????在接種了USP4基因敲低或?qū)φ誏LC細(xì)胞的小鼠中，進(jìn)一步研究了USP4表達(dá)水平對(duì)腫瘤發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)的影響。觀(guān)察到來(lái)自USP4基因敲低細(xì)胞的腫瘤有更高的腫瘤發(fā)生率和更快的生長(zhǎng)速度。與對(duì)照組細(xì)胞衍生的腫瘤相比，這些腫瘤還顯示出更高的炎癥細(xì)胞因子TNF-、IL-6和IL-8以及干性相關(guān)基因Oct4、Sox2、Nanog、KLF4、ABCG2、ALDH1、CD117和Snail1的表達(dá)水平。此外，流式細(xì)胞儀分析顯示，與對(duì)照組細(xì)胞衍生的腫瘤相比，USP4敲低細(xì)胞衍生的腫瘤中CD11b+白細(xì)胞和F4/80+巨噬細(xì)胞的積累更大。

研究結(jié)論：下調(diào)USP4能促進(jìn)小鼠的腫瘤發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、腫瘤炎癥和腫瘤干性。

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結(jié)論與討論

????????該研究揭示了一種新的促腫瘤機(jī)制，其中TAMs和腫瘤微環(huán)境的炎癥刺激促進(jìn)了Snail1的表達(dá)，同時(shí)Snail1在腫瘤細(xì)胞介導(dǎo)USP4的表觀(guān)遺傳下調(diào)。這反過(guò)來(lái)又增加了促炎癥細(xì)胞因子的釋放,使更多的巨噬細(xì)胞被招募到腫瘤微環(huán)境中，進(jìn)一步增強(qiáng)了Snail1的表達(dá)并抑制了UPS4。這種正反饋循環(huán)推動(dòng)了侵略性腫瘤細(xì)胞的快速增殖、干性增加和化療抗性的特點(diǎn)。Snail1抑制劑正在研究中。能夠阻斷這種由Snail1和USP4介導(dǎo)的正反饋環(huán)路的藥物可能能夠抑制腫瘤的發(fā)展和治療的抗性。

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