稻瘟菌（M. oryzae）引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)上嚴(yán)重的真菌病害，每年造成高達(dá) 30% 的谷物減產(chǎn)，給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

為此，今天介紹 2 篇來(lái)自中科院微生物所劉俊課題組的科研成果：

1. 使用 MST 技術(shù)進(jìn)行二元互作，揭示了水稻抗稻瘟病的新機(jī)制。

2. 借助 MST 技術(shù)完成競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析，探究了水稻針對(duì)稻瘟菌的免疫機(jī)制。

揭示水稻抗稻瘟病的新機(jī)制

Nature Communications

1. 研究背景

病原體感染通常會(huì)破壞宿主細(xì)胞，導(dǎo)致傷害相關(guān)的模式分子 (DAMPs) 產(chǎn)生，進(jìn)而激活植物的免疫反應(yīng)。稻瘟菌是否會(huì)導(dǎo)致水稻細(xì)胞壁釋放 DAMPs 尚不清楚。

2. 研究解析

2021年4月發(fā)表在Nature Communications?上題為 "Poaceae-specific cell wall-derived oligosaccharides activate plant immunity via OsCERK1 during Magnaporthe oryzae infection in rice" 的研究成果，揭示了一個(gè)水稻抗稻瘟病的新機(jī)制。

研究人員通過(guò)對(duì)稻瘟菌侵染水稻時(shí)的轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，稻瘟菌 GH12 家族基因 MoCel12A 及其同源基因 MoCel12B 在侵染早期表達(dá)量顯著升高，并被分泌至水稻質(zhì)外體。之后以水稻細(xì)胞壁中的半纖維為靶點(diǎn)進(jìn)行降解，形成寡糖，而這些寡糖被水稻的免疫蛋白復(fù)合物 OsCERK1-OsCEBiP 感知，經(jīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活免疫系統(tǒng)。

3. MST 技術(shù)應(yīng)用

研究人員使用 MST 技術(shù)基于 OsCERK1 蛋白的內(nèi)源熒光，檢測(cè)到 OsCERK1 蛋白與三種特異性寡糖的親和力分別是 1.95μM，2.9μM 和 8.38μM。在檢測(cè)時(shí)無(wú)需對(duì) OsCERK1 蛋白進(jìn)行任何標(biāo)記或固定處理，降低了樣品處理影響檢測(cè)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。

圖示 :? MST 檢測(cè)顯示 OsCERK1-ECD 與特異性寡糖結(jié)合

此外，寡糖的分子量很?。ɡ?: BGTETB MW 為667D），若使用僅基于分子量變化的互作技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，可能會(huì)出現(xiàn)信噪較低的問(wèn)題而檢測(cè)不到結(jié)合。而 MST 技術(shù)不僅僅依賴于分子量變化，結(jié)合造成的電荷、水化層和構(gòu)象等變化均可被靈敏檢測(cè)到。

水稻針對(duì)稻瘟菌的免疫機(jī)制

The Plant Cell

1. 研究背景

植物免疫系統(tǒng)可以保護(hù)它們免受大多數(shù)病原體感染。植物使用特定的蛋白質(zhì)（如受體）來(lái)識(shí)別病原體的保守特征，例如細(xì)胞壁成分等。一旦植物識(shí)別病原體，免疫系統(tǒng)就會(huì)開(kāi)啟。免疫系統(tǒng)對(duì)農(nóng)作物尤為重要，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到我們的糧食安全。水稻是世界范圍內(nèi)種植的作物之一，但它們經(jīng)常受到稻瘟菌的威脅，而稻瘟菌是如何干擾水稻免疫系統(tǒng)尚不清楚。

2. 研究解析

2019 年發(fā)表在?The Plant Cell?上題為 “Binding of the Magnaporthe oryzae Chitinase MoChia1 by a Rice Tetratricopeptide Repeat Protein Allows Free Chitin to Trigger Immune Responses”。研究人員鑒定出一種由稻瘟菌(M. oryzae)?分泌的幾丁質(zhì)酶 MoChia1（Magnaporthe oryzae chitinase 1），能夠結(jié)合幾丁質(zhì)從而抑制植物免疫反應(yīng)。通過(guò) MST 技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)水稻中的四肽重復(fù)蛋白 OsTPR1 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合 MoChia1，從而允許游離幾丁質(zhì)的積累并重新建立免疫應(yīng)答。研究表明，水稻植物不僅可以識(shí)別 MoChia1，還可以使用 OsTPR 來(lái)抵消其幾丁質(zhì)酶的功能，從而恢復(fù)免疫。

3. MST 技術(shù)應(yīng)用

圖B：MoChia1與OsTPR1 親和力檢測(cè)，Kd=0.052μM

圖C：

對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析，傳統(tǒng)的 Pull down 實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，且無(wú)法得到準(zhǔn)確的定量信息。研究人員通過(guò) MST 技術(shù)完成該三元復(fù)合體系的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合檢測(cè)，且無(wú)需任何標(biāo)記或固定。MST 結(jié)果表明， MoChia1 與 OsTPR1 之間的親和力高于 MoChia1 與幾丁質(zhì)的親和力，OsTPR1 不與幾丁質(zhì)結(jié)合。將 MoChia1 和 20μM OsTPR1 孵育后，發(fā)現(xiàn) MoChia1 與幾丁質(zhì)的親和力降低了一個(gè)數(shù)量級(jí) (Kd=1.34μM)。而在將 OsTPR1 濃度提高到 100μM 后，MoChia1 與幾丁質(zhì)間無(wú)結(jié)合。表明 OsTPR1 和幾丁質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 MoChia1，從而釋放幾丁質(zhì)，激活免疫反應(yīng)。

以上兩篇案例中的 MST 實(shí)驗(yàn)均通過(guò) Monolith 儀器的?Label-Free?通道完成，該通道的激發(fā)光為 280nm，可直接通過(guò)蛋白的內(nèi)源熒光檢測(cè)親和力，真正做到了無(wú)標(biāo)記檢測(cè)蛋白天然構(gòu)象下的結(jié)合。

> 無(wú)需固定，不受檢測(cè)樣品種類的限制

> 儀器操作簡(jiǎn)單，無(wú)需繁瑣的清洗維護(hù)

> 檢測(cè)速度快、測(cè)量范圍廣 (Kd : 從pM到mM)

> 僅需微量樣品，即可直接在溶液中測(cè)定分子間結(jié)合

參考文獻(xiàn)：

1.?Yang, C., Liu, R., Pang, J.?et al.?Poaceae-specific cell wall-derived oligosaccharides activate plant immunity via OsCERK1 during?Magnaporthe oryzae?infection in rice.?Nat Commun?12,?2178 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22456-x

2.?Yang, C., Yu, Y., Huang, J., Meng, F., Pang, J., Zhao, Q., Islam, A., Xu, N., Tian, Y., and Liu, J. Binding of theMagnaporthe oryzaechitinase MoChia1 by a rice tetratricopeptide repeat protein allows free chitin to trigger immune responses.The Plant Cell, 2019, 31: 172–188