引言

準(zhǔn)確的結(jié)合常數(shù)對(duì)于優(yōu)化藥物開發(fā)中的先導(dǎo)化合物、療效和選擇性至關(guān)重要。它們是結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）和預(yù)測(cè)新化合物結(jié)合的計(jì)算模型的基礎(chǔ)。不同的檢測(cè)方法、結(jié)合位點(diǎn)和環(huán)境會(huì)產(chǎn)生變異，因此必須謹(jǐn)慎比較數(shù)據(jù)。然而，目前參數(shù)的準(zhǔn)確度和精確度都不高，平均偏差為 0.5 對(duì)數(shù)單位，潛在差異超過 300 倍。這與制藥質(zhì)量控制規(guī)范形成了鮮明對(duì)比，凸顯了提高結(jié)合常數(shù)數(shù)據(jù)質(zhì)量的必要性。

對(duì)實(shí)驗(yàn) Ki 數(shù)據(jù)不確定性的研究包括比較 ChEMBL 數(shù)據(jù)庫中 2540 個(gè)蛋白質(zhì)配體系統(tǒng)的 7667 個(gè)獨(dú)立測(cè)量值。圖中顯示了所有配對(duì)的 pKi 值，2.5 pKi 單位的閾值表示一個(gè)數(shù)據(jù)集中允許的最大偏差。超出該閾值的偏差突出了需要改進(jìn)的地方。數(shù)據(jù)質(zhì)量直接影響預(yù)測(cè)的精確度和可靠性。例如，測(cè)量結(jié)合事件的 ?G 值，尤其是 ?S 值的估算，就需要很高的數(shù)據(jù)質(zhì)量。圖 2 展示了實(shí)驗(yàn)室內(nèi)分析方法隨時(shí)間變化的情況，突出了精確測(cè)量的重要性。

單個(gè)實(shí)驗(yàn)室的分析方法隨時(shí)間變化的一個(gè)說明性例子涉及 PDE4D 的羅利普侖和 PDE3 的西洛他胺的 IC50 值測(cè)量。測(cè)定條件和溶液處理方法的變化會(huì)產(chǎn)生變異。羅利普侖/PDE4D 和西洛他胺/PDE3 的對(duì)數(shù) IC50 值的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 σ = 0.22 和 σ = 0.17（改編自 Kalliokoski 等人 [3]）。這顯示了分析波動(dòng)對(duì)測(cè)量值的影響。

分析性能包括準(zhǔn)確度、精確度、選擇性和速度，不僅對(duì)分析人員，而且對(duì)生成數(shù)據(jù)集的下游用戶都非常重要。它為數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和合作選擇提供指導(dǎo)。為加深理解，這篇文章概述了相關(guān)檢測(cè)方法的基本原理和功能原理，并提供了性能信息匯編。

為可靠的結(jié)合常數(shù)測(cè)量選擇正確的檢測(cè)方法

生化分析--免疫分析*

免疫測(cè)定（如 ELISA）對(duì)定量生物大分子很有價(jià)值。

• 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方案不斷發(fā)展，以實(shí)現(xiàn)高精確度和數(shù)據(jù)質(zhì)量。

• 必須控制關(guān)鍵參數(shù)，如樣品稀釋順序。

• 免疫測(cè)定的驗(yàn)證和質(zhì)量評(píng)估至關(guān)重要。

表面等離子共振（SPR）檢測(cè)基于 SPR 的檢測(cè)方法可實(shí)時(shí)測(cè)量分子間的相互作用，適用于各種應(yīng)用。

• SPR 的優(yōu)勢(shì)包括測(cè)量較低的結(jié)合親和力和實(shí)時(shí)結(jié)果。

• 考慮配體量和穩(wěn)定性，以便與傳感器芯片有效共價(jià)結(jié)合。

• 穩(wěn)健性、維護(hù)和基質(zhì)會(huì)影響 SPR 檢測(cè)的可變性。

基于熒光的配體結(jié)合檢測(cè)基于熒光的檢測(cè)對(duì)于 GPCR 研究和配體結(jié)合非常重要。

• 批量結(jié)合、發(fā)射光譜分析和 FRET 等各種技術(shù)都能測(cè)量熒光強(qiáng)度。

• 面臨的挑戰(zhàn)包括熒光團(tuán)改變配體特性以及可能出現(xiàn)錯(cuò)誤結(jié)果。

• 要區(qū)分結(jié)合/未結(jié)合配體、非特異性結(jié)合和基質(zhì)效應(yīng)。

等溫滴定量熱法

1. 焓驅(qū)動(dòng)優(yōu)化有利于平衡藥物化合物。

2. ITC 將結(jié)合自由能 (ΔG)分解為焓 (ΔH) 和熵 (ΔS)。

3. 直接測(cè)量 ΔH、結(jié)合常數(shù) KD 和化學(xué)計(jì)量學(xué)。

4. 熱力學(xué)分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)。

5. 需要精確的配體和蛋白質(zhì)濃度。

6. 配體和蛋白質(zhì)緩沖液應(yīng)匹配。

7. 結(jié)合等溫線的形狀影響可靠性；c 值應(yīng)在合適的范圍內(nèi)。

8. 正確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和對(duì)照實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。

9. 配體和蛋白質(zhì)溶解度的限制會(huì)影響測(cè)量范圍。

10. 反滴定或基于競(jìng)爭的實(shí)驗(yàn)可以克服這些限制。

核磁共振

1. 用于配體結(jié)合和結(jié)構(gòu)確定。

2. 基于靶標(biāo)的方法使用化學(xué)位移擾動(dòng)（CSP）。

3. 基于配體的方法包括轉(zhuǎn)移 NOE（trNOE）、STD、waterLOGSY 等。

4. 靈敏度和信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)非常重要。

5. 配體濃度會(huì)影響靈敏度和信號(hào)質(zhì)量。

6. CSP 可用于確定結(jié)合親和力和表位。

7. 可使用適當(dāng)?shù)姆椒炕Y(jié)合親和力。

8. 可使用市售標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。

9. 應(yīng)使用深凍培養(yǎng)物和參考細(xì)胞。

10. 應(yīng)仔細(xì)驗(yàn)證準(zhǔn)確度和精密度。

親和毛細(xì)管電泳

1. 適用于研究涉及電荷變化的相互作用。

2. 適用于較弱的相互作用（KD 超過 10-6 M）。

3. 樣品量少，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短。

4. 非常適合早期發(fā)現(xiàn)階段。

基于細(xì)胞的檢測(cè)

1. 復(fù)雜的生物相關(guān)信息。

2. 考慮細(xì)胞系、培養(yǎng)基和標(biāo)本年齡。

3. 建議進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)和商業(yè)測(cè)試。

4. 儀器性能鑒定和驗(yàn)證至關(guān)重要。

5. 應(yīng)確定特異性、靈敏度、線性度和量程。

6. 精度和變異性取決于實(shí)驗(yàn)室、人員和條件。

7. 實(shí)驗(yàn)室間比較需要標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議和驗(yàn)證。

8. 取得進(jìn)展所需的參數(shù)和監(jiān)管驗(yàn)收核對(duì)表。

9. 因有望獲得更多相關(guān)生物數(shù)據(jù)而關(guān)注進(jìn)展。

檢測(cè)方法的一般比較

速度：

• SPR、免疫測(cè)定、熒光測(cè)定、無線電配體結(jié)合測(cè)定。

• ACE、MST 和 SPR 可通過多路復(fù)用加速。

精確度（KD）：

• 免疫測(cè)定、熒光測(cè)定、核磁共振、SPR 和 ACE 可達(dá)到 2-10% 的 RSD。

空間信息：

• 核磁共振（SAR by）、X 射線晶體學(xué)。

低樣品量：

• 免疫測(cè)定、熒光測(cè)定、ACE、SPR、MST。

親和力范圍：

• 極強(qiáng)親和力（<10^-9）：免疫測(cè)定、熒光測(cè)定、無線電配體結(jié)合測(cè)定、SPR、NMR。

• 低親和力（>10^-3）：SPR、NMR、ACE、MST、熒光檢測(cè)。

特異性：

• 核磁共振、免疫測(cè)定、熒光測(cè)定、無線電配體結(jié)合測(cè)定。

準(zhǔn)確性確認(rèn)：

• 使用其他方法確認(rèn)結(jié)合數(shù)據(jù)可確保準(zhǔn)確性。

優(yōu)化檢測(cè)：提高性能和精度的策略

需要優(yōu)化的參數(shù)：

選擇檢測(cè)方法時(shí)需要考慮與生物系統(tǒng)的相關(guān)性、親和力范圍、速度、穩(wěn)健性、選擇性、準(zhǔn)確性和精密度等參數(shù)。這些參數(shù)對(duì)于在規(guī)范環(huán)境中進(jìn)行檢測(cè)優(yōu)化和質(zhì)量保證至關(guān)重要。

時(shí)間要求和精度

高速檢測(cè)對(duì)于高通量系統(tǒng)和快速方法開發(fā)至關(guān)重要。精度可通過增加重復(fù)次數(shù)來提高。速度可以換取精度，復(fù)用和片上實(shí)驗(yàn)室等先進(jìn)技術(shù)可以提高分析速度。

避免常見的誤差源

隨機(jī)誤差（數(shù)據(jù)分散）和系統(tǒng)誤差（偏差）都會(huì)造成總誤差。造成誤差的因素包括不完整的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP）、實(shí)驗(yàn)參數(shù)的不可控變化、樣品制備假象、溶劑偏差以及聚集和吸附等現(xiàn)象。

優(yōu)化化驗(yàn)精度：降低方差成分

主要誤差源在總誤差中占主導(dǎo)地位。減少常見誤差源可大幅降低總誤差。需要通過徹底調(diào)查和對(duì)照實(shí)驗(yàn)來確定和了解可能影響誤差的未知相關(guān)參數(shù)。

分析經(jīng)驗(yàn)和理解

通過分析經(jīng)驗(yàn)、觀察和仔細(xì)調(diào)查，確定并了解特定技術(shù)的相關(guān)參數(shù)?？刂茖?shí)驗(yàn)的控制圖有助于確定趨勢(shì)和誤差來源。

參數(shù)分析的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，如 Plackett-Burman、分?jǐn)?shù)因子和中心復(fù)合設(shè)計(jì)，分析有影響的參數(shù)及其對(duì)總誤差的影響。這種循序漸進(jìn)的方法有助于提高精度和了解誤差的貢獻(xiàn)。

化驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)論和未來展望

識(shí)別并解決主要錯(cuò)誤源至關(guān)重要。循序漸進(jìn)的改進(jìn)可以顯著提高檢測(cè)性能，從而推動(dòng)藥物發(fā)現(xiàn)。像 ICSH/ICCS 工作組這樣的合作努力有助于取得進(jìn)展。配體結(jié)合測(cè)定的比較引發(fā)了爭論，眾說紛紜。盡管挑戰(zhàn)依然存在，但持續(xù)的討論和改進(jìn)工作有可能顯著提高數(shù)據(jù)質(zhì)量，推進(jìn)藥物發(fā)現(xiàn)過程。我們鼓勵(lì)合作討論和分享見解，以取得進(jìn)一步的進(jìn)展。

參考資料：W?tzig, H., Oltmann-Norden, I., Steinicke, F.?et al.?Data quality in drug discovery: the role of analytical performance in ligand binding assays.?J Comput Aided Mol Des?29, 847–865 (2015). https://doi.org/10.1007/s10822-015-9851-6

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