間充質(zhì)干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，在體外不同條件下誘導(dǎo)分化為骨、軟骨及其他結(jié)締組織，因其來源廣泛，分離無創(chuàng)傷，較低的免疫原性、生長周期短等特點(diǎn)，是組織工程種子細(xì)胞的重要來源。干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化一方面是干細(xì)胞鑒定的主要方法，另一方面也是干細(xì)胞功能學(xué)研究的主要途徑。采用體外條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)能夠分化為成脂肪、骨、軟骨細(xì)胞。成脂分化經(jīng)油紅O染色法鑒定，成骨分化經(jīng)茜素紅染色法鑒定，成軟骨分化經(jīng)阿爾辛藍(lán)染色法鑒定。

產(chǎn)品性能

1.細(xì)胞形態(tài)

2. 細(xì)胞表型

間充質(zhì)干細(xì)胞P20代細(xì)胞表型

流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型

3.細(xì)胞誘導(dǎo)分化

3.1 成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化操作步驟

所需材料

0.05%Trypsin-0.02%EDTA（貨號：CD05-001C）

Phosphate-BufferedSaline (1×PBS) （貨號：BS01-001C）

間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（貨號：CM01-001A）

間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號：DM01-001B）

間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號：DM02-001B）

間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（貨號：DM03-001B）

成脂誘導(dǎo)分化步驟

注意：本操作規(guī)程以六孔板為例

1. 將間充質(zhì)干細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 當(dāng)細(xì)胞生長到達(dá)對數(shù)期時，用0.05%Trypsin-0.02%EDTA進(jìn)行消化。

3. 將消化下來的間質(zhì)干細(xì)胞按照2×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。

4. 將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 每隔三天換液，直到細(xì)胞融合度達(dá)到100%或者過融合。

6. 小心地將間質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基 A 液。

7. 誘導(dǎo)3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。

8. 24h后，吸走B液，換回A液進(jìn)行誘導(dǎo)。

9. A液和B液交替作用3-5次后（12-20天），繼續(xù)用 B 液維持培養(yǎng)4-7天直到脂滴變得足夠大、圓。B 液維持培養(yǎng)期間，每隔2-3天需要換用新鮮的B液。

成脂（油紅O染色） 成骨（茜素紅染色）

成骨誘導(dǎo)分化步驟

注意：本操作規(guī)程以六孔板為例

1. 將間充質(zhì)干細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2. 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時，用0.05%Trypsin進(jìn)行消化。

3. 將消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞按照2×104 cells/cm2 的細(xì)胞密度接種在事先包被0.1%明膠的六孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基。。

4. 將細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60%-70%時，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。

6. 每隔3天換用新鮮的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基（使用前需預(yù)熱至37℃）

7. 誘導(dǎo)2-4周后，視細(xì)胞的形態(tài)變化及生長情況，用茜素紅進(jìn)行染色。

注意：為防止成骨細(xì)胞脫落，建議成骨過程中出現(xiàn)大量鈣結(jié)節(jié)之后，換液形式變?yōu)槊績商煲淮伟肓繐Q液。

成軟骨誘導(dǎo)分化步驟

1. 進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)實驗之前，需要對常規(guī)消化后的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。

2. 將3-4×105個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，250 g離心4 min。

3. 吸去上清，加入0.5 mL預(yù)混液，重懸上一步離心所得沉淀，以清洗間充質(zhì)干細(xì)胞，室溫下150 g離心5 min。

4. 重復(fù)步驟3，再次清洗細(xì)胞。

5. 將上一步所得沉淀用0.5 mL間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基重懸。

6. 室溫下150 g離心5 min。

7.擰松離心管蓋以便于氣體交換，將其放置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

注意：

① 此步驟不要吸掉上清和重懸細(xì)胞。

② 24 小時之內(nèi)不要搖動離心管。

8. 當(dāng)細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)聚攏現(xiàn)象時（一般為24 h或48 h后，實際視細(xì)胞生長情況而定）輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。

9. 自接種開始計算，每隔2-3 d 給細(xì)胞換用新鮮的成軟骨誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，每管約0.5 mL成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。

注意：小心操作，不要吸出軟骨球。

10.換液之后，輕彈離心管底部使軟骨球脫離管底懸浮在液體中。稍加擰松離心管蓋放入37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。

11.一般持續(xù)誘導(dǎo)21-28天后，可對軟骨球進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋切片，最后進(jìn)行阿利辛藍(lán)染色。

成軟骨（阿利新藍(lán)染色）