D-熒光素是流行的多功能生物發(fā)光底物，也是比較常見的實驗試劑，下面請跟著百螢一了解D-熒光素鉀鹽的實驗過程吧!

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一、 D-熒光素鉀鹽和5-氟-熒光素，作為Luciferase的作用底物，常用于以下實驗：

1.?報告基因分析

2.?In vivo imaging (動物活體成像)

3.?In vitro imaging (細胞體外分析)

4.?ATP測定

5.?其它luciferase及其基因相關(guān)的分析和研究工作

二、實驗方案

以下方案是鉀鹽和鈉鹽制備的一個例子，它可以適用于大多數(shù)細胞類型和體內(nèi)動物用途。

1.用于體外生物發(fā)光圖像測定的實施方案

1.1在無菌水中制備100mM（100-200X）熒光素原液。混合均勻。立即使用，或單獨使用等分試樣，并儲存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

1.2在預(yù)熱的組織培養(yǎng)基中制備0.5-1mM D-熒光素的工作溶液。

1.3從培養(yǎng)細胞中分離培養(yǎng)基。

1.4將熒光素工作溶液加入細胞中，并在成像前將細胞在37°C孵育5-10分鐘。

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2.用于體內(nèi)生物發(fā)光圖像測定的實施方案

2.1在DPBS中制備15mg / mL熒光素儲備溶液，不含Mg2+和Ca2+。 混合均勻。

2.2過濾器通過0.2μm過濾器過濾溶液。立即使用，或單獨使用等分試樣，并儲存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

2.3在動物體重150mg / kg（或10μL/ g熒光素儲備溶液）成像前10-15分鐘腹膜內(nèi)（i.p.）注射熒光素。

注意：應(yīng)對每種動物模型進行熒光素的動力學(xué)研究，以確定峰值信號時間。

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3.熒光素報告分析分子測定的實施方案

3.1在無菌水中制備100mM熒光素儲備溶液。 立即使用，或單獨使用等分試樣，并儲存在-20°C，避免凍融循環(huán)，避免暴露在光線下。

3.2制備1mM D-熒光素的工作溶液，其中含有3mM ATP，1mM DTT和15mM MgSO 4的25mM tricine緩沖液，pH7.8。

3.3將5-10μl細胞裂解液移入微孔板中。使用不含裂解液的裂解試劑或緩沖液作為空白。

3.4根據(jù)制造商的說明，使用熒光素工作溶液的普利光度計。

3.5注入200μl熒光素工作溶液，無延遲，10秒積分時間。

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注意1：D-熒光素鉀鹽溶于無菌水和緩沖液，溶解度可高達25mg/mL。一般使用濃度為3-15 mg/mL。溶液的pH值、溶液中的氧氣和保存時間對其保存過程中的穩(wěn)定性非常重要。當(dāng)溶液的pH<6.5（發(fā)生水解作用）或>7.5（發(fā)生消旋化作用，D型轉(zhuǎn)化為L型）的情況下，D-熒光素鉀鹽相對不穩(wěn)定。如果溶液中存在少量的氧氣，將加速D-熒光素鉀的降解速度。儲備溶液可以在不含ATP的水中制備，并在-20°C下避光儲存。必須用適當(dāng)?shù)膲A中和游離酸溶解。

注意2：D-熒光素可與任何現(xiàn)有的文獻或ATP分析系統(tǒng)一起使用。

注意3：如果檢測ATP，請戴上手套并使用無ATP容器，盡量減少所有可能的ATP污染源。僅使用無菌無ATP水和試劑。使用高壓水進行所有試劑制備。

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三、試劑應(yīng)用文獻

Bioluminescence imaging of Arc expression in mouse brain under acute and chronic exposure to pesticides
Authors:?Izumi, Hironori and Ishimoto, Tetsuya and Yamamoto, Hiroshi and Mori, Hisashi
Journal:?NeuroToxicology (2018)

Cytotoxicity Burst? Differentiating Specific from Nonspecific Effects in Tox21 in Vitro Reporter Gene Assays
Authors:?Escher, Beate I and Henneberger, Luise and K{\"o}nig, Maria and Schlichting, Rita and Fischer, Fabian C
Journal:?Environmental health perspectives?(2020):?077007

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IL4I1 is a metabolic immune checkpoint that activates the AHR and promotes tumor progression
Authors:?Sadik, Ahmed and Patterson, Luis F Somarribas and {\"O}zt{\"u}rk, Selcen and Mohapatra, Soumya R and Panitz, Verena and Secker, Philipp F and Pf{\"a}nder, Pauline and Loth, Stefanie and Salem, Heba and Prentzell, Mirja Tamara and others,
Journal:?Cell?(2020):?1252--1270

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Bioluminescence reporter for monitoring G2-phase cell cycle arrest in vivo.
Authors:?Yu, Jian-Bo and Jing, Ya-Jie and Jin, Zai-Shun and Li, Qi and Meng, Xiang-Yu and Chen, Zhi-Hong
Journal:?Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences?(2020)

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Genome-wide microRNA analysis identifies miR-188-3p as novel prognostic marker and molecular factor involved in colorectal carcinogenesis
Authors:?Pichler, Martin and Stiegelbauer, Verena and Vychytilova-Faltejskova, Petra and Ivan, Cristina and Ling, Hui and Winter, Elke and Zhang, Xinna and Goblirsch, Matthew and Wulf-Goldenberg, Annika and Ohtsuka, Masahisa and others, undefined
Journal:?American Association for Cancer Research?(2016):?clincanres--0497

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C3-Luc Cells Are an Excellent Model for Evaluation of Cellular Immunity following HPV16L1 Vaccination
Authors:?Li, Li-Li and Wang, He-Rong and Zhou, Zhi-Yi and Luo, Jing and Wang, Xiao-Li and Xiao, Xiang-Qian and Zhou, Yu-Bai and Zeng, Yi
Journal:?PloS one?(2016):?e0149748

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Identification of a novel protein kinase a inhibitor by bioluminescence-based screening
Authors:?Ishimoto, Tetsuya and Azechi, Kenji and Mori, Hisashi
Journal:?Biological and Pharmaceutical Bulletin?(2015):?1969--1974

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Identification of a Novel Protein Kinase A Inhibitor by Bioluminescence-Based Screening
Authors:?Ishimoto, Tetsuya and Azechi, Kenji and Mori, Hisashi
Journal:?Biological and Pharmaceutical Bulletin?(2015):?1969--1974