前言

近日，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士、復(fù)旦大學(xué)朱棣研究員、復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院徐泱副教授作為共同通訊作者，在 Cancer Discovery (IF:39.397) 雜志發(fā)表了題為的研究論文，報(bào)道了干擾素-α通過(guò)糖代謝重塑腫瘤免疫微環(huán)境激活免疫應(yīng)答，克服免疫檢查點(diǎn)阻斷治療（ICB）耐藥，并提出兩者聯(lián)合治療肝癌的新策略。

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胡博主治醫(yī)師、喻敏成博士、馬曉路技師、孫嘉磊博士、復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院劉成龍為論文的共同第一作者，文章中轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析服務(wù)由歐易生物完成。

研究背景

肝細(xì)胞癌（HCC）是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因，抗PD-1/PD-L1抗體是目前HCC患者進(jìn)行ICB治療的主要藥物之一。與此同時(shí)，IFN-α被認(rèn)為是潛在的腫瘤治療藥物，可以直接阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤擴(kuò)張。近些年的研究確定IFN-α和抗PD-1抗體是一種很有前途的治療策略，也表明基于IFN-α的聯(lián)合治療ICB的潛在價(jià)值。盡管如此，IFN-α與ICB協(xié)同的機(jī)制以及IFN-α與ICB聯(lián)合是否有利于HCC仍不清楚。

研究?jī)?nèi)容

本研究根據(jù)臨床數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合IFN-α與抗PD-1抗體可顯著縮小部分肝細(xì)胞肝癌患者的腫瘤體積，并對(duì)抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移有明顯效果。為探究背后的分子機(jī)制，構(gòu)建小鼠原位和自發(fā)肝癌模型發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療組極大地抑制免疫健全小鼠肝癌進(jìn)展。隨后運(yùn)用高通量質(zhì)譜流式分析不同治療組腫瘤微環(huán)境，鎖定CD27+CD8+ T細(xì)胞。通過(guò)RNA-seq進(jìn)一步探索CD27+CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IFN-α重新編程HCC腫瘤微環(huán)境中的葡萄糖代謝，從而使T細(xì)胞細(xì)胞毒性能力釋放并增強(qiáng)了PD-1阻斷誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這些研究結(jié)果表明，IFN-α和抗PD-1 聯(lián)合治療是HCC患者的有效新型組合策略。

研究路線

研究結(jié)果

不可切除HCC 患者對(duì)基于IFN-α的抗PD-1免疫聯(lián)合治療有顯著的臨床反應(yīng)

本研究觀察了15例不可切除HCC患者接受基于IFN-α的抗PD-1免疫聯(lián)合治療的療效，ORR 達(dá)到80%（圖 1A-B）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療可顯著縮小部分HCC患者的腫瘤體積，并對(duì)抑制肝癌肺轉(zhuǎn)移有明顯效果（圖 1C-D）。隨后使用流式細(xì)胞術(shù)在15例接受聯(lián)合治療的患者外周血中檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞的富集（圖 1E-F）。這些發(fā)現(xiàn)共同支持不可切除HCC 患者對(duì)基于IFN-α的抗PD-1免疫聯(lián)合治療有顯著的臨床反應(yīng)。

圖1 | IFN-α 增強(qiáng)基于抗 PD-1 的免疫治療在 HCC 中的療效

IFN-α治療增強(qiáng)了抗PD-1抗體在小鼠HCC模型中的療效

為了探討聯(lián)合治療療效提高的機(jī)制，構(gòu)建了小鼠原位移植瘤模型和自發(fā)性肝癌模型。在小鼠原位和自發(fā)性肝癌模型中，聯(lián)合治療比單獨(dú)IFN-α或抗PD-1治療促使更大的腫瘤消退，總生存率也顯著提高（圖 2A-E）。同時(shí)也觀察到聯(lián)合治療可導(dǎo)致嚴(yán)重的腫瘤壞死和肺轉(zhuǎn)移灶完全消除（圖 2F-G），而這一治療效果在清除小鼠體內(nèi)CD8+ T細(xì)胞后完全消失（圖 2H-I）。總之，這些研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了IFN-α增強(qiáng)了抗PD-1抗體治療HCC的臨床療效。

圖2 | IFN-α 增強(qiáng)抗 PD-1 免疫療法的療效并改變腫瘤微環(huán)境的免疫格局

高維分析顯示，抗PD-1 聯(lián)合 IFN-α 治療后 CD27+CD8+ T 細(xì)胞富集

鑒于癌癥免疫治療主要取決于T細(xì)胞浸潤(rùn)腫瘤微環(huán)境，接下來(lái)進(jìn)一步評(píng)估哪種T細(xì)胞群有助于改善聯(lián)合治療的抗癌效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-α和抗PD-1抗體聯(lián)合治療以CD8+T細(xì)胞依賴的方式消除腫瘤細(xì)胞（圖 3A-B），通過(guò)質(zhì)譜流式和多色免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)聯(lián)合治療小鼠的腫瘤組織中CD27+CD8+T細(xì)胞亞群的浸潤(rùn)程度顯著升高（圖 3C-F）。公共HCC數(shù)據(jù)集的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析也佐證上述觀點(diǎn)（圖 3H-J），同時(shí)在CD27高表達(dá)的CD8+T細(xì)胞中，PD-1的表達(dá)也升高（圖 3K-L）。因此推測(cè)CD27+CD8+T細(xì)胞亞群介導(dǎo)了聯(lián)合治療的抗腫瘤作用，而CD27是CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能的關(guān)鍵因素。

圖3 | 通過(guò)CyTOF深入鑒定T細(xì)胞室

IFN-α 通過(guò)抑制 HIF1α 誘導(dǎo)的 HCC 糖酵解增強(qiáng)抗 PD-1 功效

為了進(jìn)一步闡明IFN-α增強(qiáng)抗PD-1療效的機(jī)制，通過(guò)RNA-seq技術(shù)確定抗PD-1治療后的小鼠原位肝癌細(xì)胞（Hepa1-6）轉(zhuǎn)錄改變。GSEA分析表明腫瘤細(xì)胞經(jīng)聯(lián)合治療后，HIF1α信號(hào)通路明顯受到抑制（圖 4A-B）。通過(guò)ECAR實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、HIF1α敲除等系列的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)抗PD-1處理肝癌細(xì)胞展現(xiàn)出極強(qiáng)的糖酵解能力，而干擾素正是通過(guò)糾正“腫瘤-免疫微環(huán)境”之間糖代謝競(jìng)爭(zhēng)失衡發(fā)揮作用（圖 4D-Q）。綜上所述，IFN-α可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的HIF1α信號(hào)，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的HIF1α信號(hào)和細(xì)胞活性，有效提高HCC的抗PD-1治療療效。

圖4 | HCC 細(xì)胞中 HIF1α 信號(hào)異常激活以改變 T 細(xì)胞糖酵解狀態(tài)，而 IFN-α 治療可恢復(fù) T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力

IFN-α以 IRF1 依賴的方式抑制 FosB 的表達(dá)，調(diào)節(jié)抗 PD-1 治療后HIF1α 信號(hào)

為了探究HIF1α信號(hào)在上述過(guò)程中調(diào)控的分子機(jī)制，通過(guò)RNA-seq技術(shù)檢測(cè)Hepa1-6細(xì)胞在接受治療后的差異表達(dá)基因，根據(jù)表達(dá)和功能鎖定FosB分子（圖 5A）。通過(guò)co-IP、CHIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)osB可與HIF1α互作，沉默F(xiàn)osB顯著降低了HIF1α對(duì)其糖酵解相關(guān)靶點(diǎn)基因的表達(dá)（圖 5D-I）。同時(shí)，通過(guò)挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IRF1在IFN-α調(diào)控的FosB表達(dá)中發(fā)揮作用（圖 5L-N）?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明 IFN-α 以 IRF1 依賴性方式來(lái)抑制 FosB 表達(dá)，從而削弱HIF1α介導(dǎo)的糖酵解作用。

圖5?| IFN-α通過(guò)抑制 IRF1 依賴型中 FosB 轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制 HIF1α 信號(hào)傳導(dǎo)

高糖微環(huán)境通過(guò) mTOR 誘導(dǎo)的 FOXM1 表達(dá)促進(jìn) CD27 轉(zhuǎn)錄

有報(bào)道m(xù)TOR信號(hào)有在微環(huán)境中感知葡萄糖和調(diào)節(jié)T細(xì)胞糖酵解的重要作用，本研究發(fā)現(xiàn)在高糖環(huán)境下，mTOR信號(hào)在調(diào)節(jié)CD27表達(dá)中發(fā)揮重要作用（圖 6A-B）。之后使用公共的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)FOXM1在CD27高表達(dá)細(xì)胞中有顯著表達(dá)（圖 6C）。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)聯(lián)合治療的CD8+T細(xì)胞顯示出FOXM1的高表達(dá)（圖 6D-F）。隨后通過(guò)FOXM1敲除實(shí)驗(yàn)和免疫印跡分析，確定mTOR-FOXM1-CD27的上下游關(guān)系（圖 6G）。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了高糖微環(huán)境可以觸發(fā)mTOR信號(hào)激活，導(dǎo)致FOXM1過(guò)表達(dá)和隨后的CD27的轉(zhuǎn)錄。

圖6?| HCC 細(xì)胞中 HIF1α 信號(hào)異常激活以改變 T 細(xì)胞糖酵解狀態(tài)，而 IFN-α 治療可恢復(fù) T 細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力

CD27+CD8+T 細(xì)胞與基于 PD-1 治療的免疫應(yīng)答和 HCC 的存活相關(guān)

使用臨床數(shù)據(jù)結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)后分析，發(fā)現(xiàn)CD8或CD27高表達(dá)的HCC患者預(yù)后明顯優(yōu)于低表達(dá)（圖 7A-B）。通過(guò)多色熒光實(shí)驗(yàn)和單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析，CD27+CD8+T細(xì)胞亞群與抗PD-1 治療患者的免疫應(yīng)答相關(guān)（圖 7C-D）。總之，這些數(shù)據(jù)證實(shí)CD27+CD8+T細(xì)胞與HCC患者生存率和接受PD-1阻斷免疫治療的HCC患者的免疫應(yīng)答相關(guān)。

圖7?| CD27 + CD8 的組合在基于抗 PD-1 療法治療多種癌癥類型中有良好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力

研究結(jié)論

（1）腫瘤糖代謝在IFN-α介導(dǎo)的HCC抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用；

（2）腫瘤浸潤(rùn)性CD27 + CD8 + T細(xì)胞可用于抗PD-1治療分型的生物標(biāo)志物；

（3）IFN-α和抗PD-1聯(lián)合治療是HCC患者的一種有效的新聯(lián)合策略。

參考文獻(xiàn)：

Hu B, Yu M, Ma X, Sun J, Liu C, Wang C, Wu S, Fu PY, Yang Z, He Y, Zhu Y, Huang C, Yang X, Shi Y, Qiu S, Sun H, Zhu AX, Zhou J, Xu Y, Zhu D, Fan J. Interferon-a potentiates anti-PD-1 efficacy by remodeling glucose metabolism in the hepatocellular carcinoma microenvironment. Cancer Discov. 2022 Apr 12:candisc.1022.2021. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-1022.

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