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引言

生物分析通常指在動物和人體的體液或組織中對生物藥進(jìn)行定量測定，包括單抗、細(xì)胞因子、生長素、融合蛋白等的濃度。絕大多數(shù)生物藥的生物分析方法都基于免疫測試方法（Immunoassays）。ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯(lián)免疫分析法）是一種常用的生物分析方法，其利用抗原或抗體吸附在固相載體表面，結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，通過抗原抗體特異性結(jié)合，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體進(jìn)行定性或定量分析。

ELISA法的基本類型

ELISA可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型。非均相酶聯(lián)免疫分析法是比較常用的方法。根據(jù)固相載體區(qū)分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即通常所指的ELISA（微量板ELISA）；一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA，稱為斑點(diǎn)ELISA（Dot-ELISA）；一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C-ELISA）。常見的ELISA格式根據(jù)其性質(zhì)不同分為直接ELISA法、間接ELISA、雙抗夾心ELISA、競爭ELISA法，圖1展示了4種ELISA測試格式。

ELISA法在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用

PK（PharmacoKinetics）檢測

PK是藥物研發(fā)過程中重要的組成部分，在早期階段可能無法得到mAbs或pAbs，通常選擇重組配體（即治療靶點(diǎn)）作為關(guān)鍵試劑來測定游離治療蛋白(free therapeutic protein, TP)濃度。雖然該方法僅能測定（結(jié)合靶標(biāo)后的TP 和游離的TPf）總濃度，但是在早期臨床研究中，對于有Fc部分的抗體，仍會選用ELISA進(jìn)行藥物的PK檢測。

生物標(biāo)志物

與PK方法相似，生物標(biāo)志物法可以用于測量預(yù)期基質(zhì)中生物標(biāo)志物蛋白的游離或總濃度。生物標(biāo)志物通常會采用配體結(jié)合方法（LBA）或者LC-MS/MS方法進(jìn)行檢測。由于生物基質(zhì)中進(jìn)行檢測的生物標(biāo)志物大部分是大分子的蛋白或者多肽，LBA的方法運(yùn)用的更為廣泛。夾心法測試格式是主要選擇，通常用于測量游離或總濃度的生物標(biāo)志物。

免疫原性檢測

在早期臨床前試驗(yàn)系統(tǒng)中，治療性蛋白藥物如人源化/全人源單克隆抗體或重組蛋白，可誘導(dǎo)形成抗藥物抗體。藥物誘導(dǎo)形成的抗體通常被稱為抗藥物抗體（ADA），免疫原性檢測是檢測ADA是否存在于血清中的第一級分析。ADA可與血液循環(huán)中的藥物形成復(fù)合物，高濃度的治療蛋白藥物會干擾ADA檢測。對生物類似藥與創(chuàng)新藥以及抗體-藥物偶聯(lián)物來講，都大大增加了生物分析方面的挑戰(zhàn)和免疫原性評估的復(fù)雜性。

ELISA方法學(xué)建立考量點(diǎn)

首先明確ELISA方法開發(fā)的目的，如果是進(jìn)行大分子定量，包被的抗原遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量是方法穩(wěn)定的必然選擇；如果是進(jìn)行ELISA的親和力分析，包被的抗原少量是方法穩(wěn)定的必然選擇。其次是做好平臺的搭建工作，如關(guān)鍵試劑的選擇和穩(wěn)定性、測試格式的選擇（抗體、稀釋液、微孔板、檢測系統(tǒng)等）、標(biāo)準(zhǔn)曲線模型的選擇、樣本基質(zhì)的選擇、試劑的特異性、樣本制備等需要方法開發(fā)初期進(jìn)行摸索，評估方法的穩(wěn)健性（robustness）。同時開發(fā)出來的方法需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，生物學(xué)活性測定方法驗(yàn)證的目的就是要對引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果變異和偏差的各種因素進(jìn)行評價，以確定實(shí)驗(yàn)方法的可靠性和可行性，應(yīng)考慮生物學(xué)活性測定方法的特點(diǎn)：

（1）生物學(xué)活性是相對活性，必須對單位有一個適當(dāng)?shù)亩x或以有關(guān)機(jī)構(gòu)頒布的標(biāo)品或參考品作為對照。

（2）樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的劑量反應(yīng)曲線必須是平行的，即樣品和標(biāo)準(zhǔn)品除了有效活性不同之外，必須是相同的。

（3）應(yīng)對方法的變異性進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以確定生物學(xué)活性可接受的有效范圍。效價測定的變異來源因素有:單次試驗(yàn)的變異性；在同一天試驗(yàn)的變異；不同實(shí)驗(yàn)日造成變異；不同實(shí)驗(yàn)者造成的變異；不同分析方法造成的變異；不同實(shí)驗(yàn)室引起的變異。應(yīng)對這些變異因素進(jìn)行綜合分析。
（4）應(yīng)對引起系統(tǒng)偏差的某些因素進(jìn)行綜合分析：不同的實(shí)驗(yàn)平板；在平板的不同位置（邊緣效應(yīng)）；檢測次序（加樣先后）。

96孔板測定生物學(xué)活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計舉例

采用96孔板測定生物學(xué)活性是活性檢測常用手段，一致性實(shí)驗(yàn)就是在96孔板上所有的孔都加入相同濃度的所有試劑，包括已知濃度的活性參考品，考察各種因素對檢測結(jié)果的影響。其中主要考慮以下幾點(diǎn)因素：(1)位置效應(yīng)的影響：位于板上不同位置的樣品對檢測結(jié)果的影響。(2)序列稀釋隨機(jī)化影響:多通道加樣器實(shí)際上很難使樣品濃度及板上的位置完全隨機(jī)化。表2和表3分別展示兩種考察位置效應(yīng)和序列隨機(jī)化考量因素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計案例，其中表2（分段設(shè)計）將樣品隨機(jī)分配至行、濃度至列，表3（分區(qū)設(shè)計）樣品和濃度特異組合形成一個區(qū)域，兩種實(shí)驗(yàn)設(shè)計可排除位置因素和序列稀釋因素對檢測結(jié)果的影響，多個維度考察，評估實(shí)驗(yàn)方法建立的穩(wěn)健性。

總之，生物技術(shù)產(chǎn)品的檢測由于其特有的生物測定變異性，不同的測定方法和反應(yīng)原理在驗(yàn)證時應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)行不同參數(shù)的測定，有時還需要考察樣品保存條件、處理方法等因素對測定結(jié)果的影響。

結(jié)語

以上是關(guān)于ELISA簡介與應(yīng)用，以及活性檢測方法建立過程中需要考量的要點(diǎn)描述，良好的方法驗(yàn)證對于評價生物技術(shù)藥物質(zhì)量具有至關(guān)重要的意義,驗(yàn)證方法的科學(xué)性反映了采用該方法進(jìn)行檢測結(jié)果的可靠性。方法學(xué)的驗(yàn)證可以參考2020版中國藥典四部9012《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》、9401《生物制品生物活性/效價測定方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》以及USP<1032>、<1033>、<1034>里面有較詳細(xì)的生物活性方法驗(yàn)證方案設(shè)計、結(jié)果統(tǒng)計學(xué)分析的案例。熟悉ELISA原理對于生物學(xué)活性的開發(fā)和評價具有重要的指導(dǎo)意義。

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