研究基因點(diǎn)突變?cè)谔剿鲉?dòng)子調(diào)節(jié)位點(diǎn)，研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系以及改造、優(yōu)化基因等方面都具有舉足輕重的地位。那什么是點(diǎn)突變呢？顧名思義，點(diǎn)突變就是指DNA上的某一點(diǎn)發(fā)生了突變，而這個(gè)“點(diǎn)”正是一個(gè)核苷酸堿基。

一、點(diǎn)突變的分類?

由于點(diǎn)突變?cè)贒NA的各個(gè)位點(diǎn)都有可能發(fā)生，最終導(dǎo)致了基因功能發(fā)生不同類型的突變，因此根據(jù)突變的位置和功能都能對(duì)點(diǎn)突變進(jìn)行分類：

?1、根據(jù)突變的位置進(jìn)行分類：?

（1）編碼區(qū)域

• 沉默突變：盡管堿基序列發(fā)生了變化，但通常這種類型突變并不會(huì)導(dǎo)致整合進(jìn)多肽鏈中的氨基酸發(fā)生變化，從而不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成影響，因此被稱為沉默突變。

• 錯(cuò)義突變：該類突變會(huì)導(dǎo)致整合進(jìn)多肽鏈的氨基酸種類發(fā)生變化，所以錯(cuò)義突變對(duì)基因表達(dá)的影響主要取決于突變后的新氨基酸與野生型氨基酸在化學(xué)性質(zhì)上的差異。

• 無義突變：該類突變會(huì)導(dǎo)致編碼某種氨基酸的密碼子（有義密碼子）轉(zhuǎn)換為終止密碼子（無義密碼子），所以發(fā)生了無義突變的基因所編碼的氨基酸鏈會(huì)比野生型的要短，并且這些氨基酸鏈通常無法正常發(fā)揮它的作用。

（2）非編碼區(qū)：雖然在基因的非編碼區(qū)內(nèi)發(fā)生的點(diǎn)突變看起來不會(huì)影響到最終的基因表達(dá)產(chǎn)物，但研究結(jié)果表明發(fā)生在非編碼區(qū)的點(diǎn)突變對(duì)基因的表達(dá)和功能同樣會(huì)產(chǎn)生很大的影響，原因如下：

• 內(nèi)含子可能包含某些能夠結(jié)合其他可轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子或沉默子（當(dāng)然，這些元件并不是基因表達(dá)所必需的）的序列，因此在這些區(qū)域中形成的突變是有可能影響基因的轉(zhuǎn)錄。

• 內(nèi)含子還會(huì)包含非編碼RNA的序列（如miRNA，lincRNA），這些序列可能會(huì)影響所在基因（和/或其他基因）的mRNA的翻譯和穩(wěn)定性。當(dāng)點(diǎn)突變的發(fā)生改變了這些RNA的序列或影響加工過程時(shí)就一定會(huì)改變基因產(chǎn)物的生成情況。

• 在RNA剪接過程中，內(nèi)含子會(huì)有更高級(jí)別的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)內(nèi)含子中的剪接信號(hào)發(fā)生了突變（剪接因子結(jié)合的地方），這有可能會(huì)改變內(nèi)含子這一調(diào)節(jié)功能。在這些區(qū)域中的突變可能導(dǎo)致產(chǎn)生差異剪接或截短的產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物可能是不起作用的，甚至有了不同的功能。

• 在翻譯水平上，UTR參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生產(chǎn)的活性，因此在UTR（非編碼區(qū)）的突變可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成量。

2、根據(jù)突變的功能進(jìn)行分類：?

（1）Loss of function:在野生型二倍體細(xì)胞中，基因有兩個(gè)野生型等位基因，均有正?；虍a(chǎn)物。但是在雜合子中，單個(gè)野生型等位基因可能也能提供足夠的正?；虍a(chǎn)物以產(chǎn)生野生型表型。在這種情況下，功能喪失性突變是隱性的。在某些情況下，細(xì)胞可以“上調(diào)”單個(gè)野生型等位基因的活性水平。因此在雜合子中的單個(gè)野生型等位基因的基因產(chǎn)物的總量是純合野生型基因產(chǎn)物的一半以上。但是，某些功能喪失性突變也可以是顯性的。在這種情況下，雜合子中的單個(gè)野生型等位基因不能像野生型一樣提供細(xì)胞和生物體所需的基因產(chǎn)物量。因此，loss of function是指具有較弱功能或沒有功能的基因產(chǎn)物（部分或完全失活）。

?（2）Gain of function:其基因產(chǎn)物被改變而具有了新的分子功能或新的基因表達(dá)模式的一種突變。功能獲得性突變幾乎總是顯性或半顯性的。但是在雜合子的情況下，會(huì)表達(dá)新功能。因此功能獲得性突變很可能像顯性等位基因一樣起作用并產(chǎn)生新的表型。

二、如何利用基因編輯技術(shù)研究基因點(diǎn)突變細(xì)胞系??

CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以在許多生物體中進(jìn)行針對(duì)基因組序列的編輯，并有望成為構(gòu)建人類疾病模型的主要工具，如人多能干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系。通過現(xiàn)代測(cè)序，CRISPR技術(shù)可以在各種細(xì)胞系中引入精確的點(diǎn)突變（純合/雜合），并且能夠構(gòu)建人類疾病模型。這是有利于研究疾病治療和基礎(chǔ)基因組。多年來，細(xì)胞模型已被證明是可用于復(fù)制/模仿人類疾病。 CRISPR/Cas9可以高效地引入靶向雙鏈斷裂（DSB）。這些DSB可以通過使用DNA修復(fù)模板（例如引入的單鏈寡DNA核苷酸，即ssODN），通過同源定向修復(fù)（HDR）系統(tǒng)修復(fù)，從而完成特定突變的敲入?；贑RISPR的敲入基因組編輯框架允許研究人員選擇性引入單等位基因和雙等位基因的序列變化，以及引入雜合和純合點(diǎn)突變，以構(gòu)建致病性疾病模型。純合點(diǎn)突變需要gRNA靶向接近目標(biāo)突變的位置，而雜合點(diǎn)突變可以通過距離依賴性次優(yōu)突變的摻入或通過使用混合修復(fù)模板來實(shí)現(xiàn)。CRISPR介導(dǎo)的敲入點(diǎn)突變對(duì)于功能獲得（GOF）或功能喪失（LOF）研究非常有用。CRISPR介導(dǎo)的敲入點(diǎn)突變具有巨大的潛力，可以改善受此疾病影響的患者的預(yù)后能力，并最終可能為問診和疾病靶向開辟新途徑。?基于目前可用的基因工程工具，大部分研究人員愿意去開發(fā)針對(duì)人類疾病的細(xì)胞模型，以了解疾病發(fā)展的機(jī)制和潛在的治療方法。

1、點(diǎn)突變雜合基因型的模型：?在二倍體生物體中，僅在基因的一個(gè)等位基因上發(fā)生的突變稱為雜合突變。雜合就意味著一個(gè)人有兩種不同版本的基因（一種遺傳自一個(gè)親本，另一種遺傳自另一個(gè)親本）。在由顯性基因引起的疾病中，一個(gè)人只需要攜帶有一個(gè)致病基因拷貝就能表現(xiàn)出異常（患?。?。由于基因優(yōu)勢(shì)性質(zhì)，只要有一個(gè)受影響基因（從父母某一方繼承）的人就基本都會(huì)患病。因此，如果是顯性基因引起的疾病，那么雜合子也有可能表現(xiàn)出疾病。如果是隱性基因引起的疾病，那么雜合子可能不會(huì)發(fā)展成疾病或其影響較小。雜合點(diǎn)突變相關(guān)疾病——中心核肌病就是其中一個(gè)例子。 中心核肌病是一種以肌肉無力（肌?。┖凸趋兰∠轂樘卣鞯募膊?。中心核肌病患者從出生到成年早期可以隨時(shí)開始出現(xiàn)肌肉無力。隨著時(shí)間的推移，肌肉無力的癥狀逐漸惡化，并可能導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)技能如爬行或行走會(huì)比別人開發(fā)得要慢；運(yùn)動(dòng)過程中會(huì)出現(xiàn)肌肉疼痛；以及行走困難。隨著肌肉萎縮和無力的情況變得更加嚴(yán)重，一些嚴(yán)重受影響的人可能需要輪椅的幫助。在極少數(shù)情況下，肌肉無力會(huì)隨著時(shí)間而改善。中心核肌病通常是由Dnm2，BIN1或TTN基因突變引起的。當(dāng)中心核肌病是由Dnm2基因突變引起的時(shí)，它以常染色體顯性遺傳方式遺傳，這意味著每個(gè)細(xì)胞中Dnm2基因改變的一個(gè)拷貝足以引起該疾病。Dnm2相關(guān)的中心核肌病主要由雜合的單點(diǎn)突變引起。人類的CGG密碼子編碼位于465位氨基酸的保守精氨酸，但在Dnm2相關(guān)的中心核肌病患者中，位于465位氨基酸的CGG密碼子變?yōu)門GG，編碼色氨酸。 阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer's disease, AD）是一種破壞性神經(jīng)退行性疾病，占所有形式癡呆的50-75%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年全球約有4400萬人被診斷患有阿爾茨海默氏病或相關(guān)癡呆癥。每年報(bào)告約460萬新增癡呆病例，預(yù)計(jì)到2030年阿爾茨海默氏病患者人數(shù)將增加近一倍。遺傳因素可以解釋許多影響阿爾茨海默氏病風(fēng)險(xiǎn)的變異，特別是家族性和早發(fā)性阿爾茨海默氏?。╡arly-onset AD），其中大多數(shù)遺傳變異與淀粉樣β（amyloid-β）加工有關(guān)。早發(fā)性阿爾茨海默氏病是阿爾茨海默氏病的一種亞型，其發(fā)病年齡在65歲以前，但有幾例患者在30或40多歲時(shí)發(fā)生AD。三種基因已被確定為早發(fā)性阿爾茨海默氏病的致病因子：淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein, APP），早老素1（presenilin 1, PSEN1）和早老素2（presenilin 2, PSEN2）。阿爾茨海默氏病是雜合點(diǎn)突變相關(guān)疾病之一。

2、點(diǎn)突變純合基因型的模型：?在同一基因的兩個(gè)等位基因上發(fā)生的相同突變稱為純合突變。純合點(diǎn)突變疾病的其中一個(gè)例子是Tay-Sachs病（TSD）。TSD是一種致命的常染色體隱性遺傳疾病，最常見于兒童。TSD是由位于15號(hào)染色體上的HEXA（己糖胺酶A）基因突變引起的。如果沒有位于15號(hào)染色體上的正常的HEXA，稱為GM2神經(jīng)節(jié)苷脂的脂肪物質(zhì)或脂質(zhì)會(huì)在細(xì)胞中異常積累，尤其在大腦的神經(jīng)細(xì)胞中異常積累。這種持續(xù)的積累導(dǎo)致細(xì)胞的漸進(jìn)性損傷并導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病。HEXA基因中有近130個(gè)突變被報(bào)告會(huì)引起TSD及其變異，包括單堿基取代，小缺失，重復(fù)和插入剪接改變，以及復(fù)雜的基因重排和部分大重復(fù)。在德系猶太人中，94%-98%的患者是由c.1277_1278insTATC, c.1421 + 1 G > C and c.805 G > A (p.G269S).三種常見突變之一引起的。在非德系猶太人中也發(fā)現(xiàn)了c.805 G A（p.G269S）突變，以及在9號(hào)內(nèi)含子中的剪接位點(diǎn)突變（c.1073+1 G A）。但目前并沒有治療或治愈的方法。 囊性纖維化（Cystic Fibrosis, CF）是一種隱性遺傳疾病，在歐洲人后裔中最為常見。在美國(guó)，每3500名新生兒中就有1名患有囊性纖維化，而每30名白種人中就有1名是攜帶者。有許多不同的突變可以導(dǎo)致囊性纖維化，但最常見的突變是CFTR基因（囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)劑）中有三個(gè)核苷酸的缺失，導(dǎo)致氨基酸苯丙氨酸的丟失并導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤。（請(qǐng)注意，這種缺失不是一種移碼突變，因?yàn)楸舜讼噜彽?個(gè)堿基被刪除，鏈中所有其他氨基酸保持不變。）囊性纖維化的癥狀常伴有肺中粘稠的粘液和呼吸困難，咸汗，在某些群體還會(huì)有不育，和預(yù)期壽命縮短（在發(fā)達(dá)國(guó)家中約42-50歲）。

源井生物在CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎(chǔ)上自主研發(fā)的CRISPR-U?能以更高的效率基因，同時(shí)可以大幅度提升同源重組效率，輕松實(shí)現(xiàn)基因點(diǎn)突變（PM）。同時(shí)由源井生物重磅打造的基因編輯自動(dòng)方案免費(fèi)系統(tǒng)——紅棉CRISPR基因編輯系統(tǒng)，富集5000多例基因編輯大數(shù)據(jù)，涵蓋人、小鼠、大鼠、斑馬魚等10大物種，助力您構(gòu)建合適的點(diǎn)突變細(xì)胞模型！