今天給同學們分享一篇泛素化+分型+預后的生信文章“Establishment and validation of a ubiquitination-related gene signature associated with prognosis in pancreatic duct adenocarcinoma”，這篇文章于2023年6月9日發(fā)表在Front Immunol期刊上，影響因子為8.738。

胰管腺癌（PDAC）通常被稱為“癌癥之王”。其預后極差，是全球癌癥相關死亡的第四大原因。由于PDAC早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，只有少部分個體能夠在早期被確定診斷，而絕大多數(shù)人在更晚期被診斷出來。盡管近年來在PDAC的系統(tǒng)治療方面取得了突破，但晚期疾病的預后仍然令人沮喪，這是由于該疾病的局部快速進展和頻繁的遠處轉移。因此，找到一些可能調控PDAC發(fā)生和進展的關鍵基因，并作為PDAC的新型治療靶點，非常重要。

圖1 當前研究的流程圖

1. PDAC中URGs集群的鑒定

首先，使用一種共識聚類方法分析了URGs表達與PDAC亞型之間的關聯(lián)。如圖2A-C所示，應用CDF曲線將PDAC患者分為兩個聚類（C1和C2）。與C2相比，被診斷為PDAC的C1個體的存活期明顯較短（圖2D）。圖2E展示了URG聚類、臨床特征和PDAC患者URGs表達之間的相關性。大多數(shù)URGs在C1中的表達較C2高，而C1樣本的分級較高，而T、N、分期、年齡和性別在C1和C2之間沒有顯著差異。

圖2 URG亞型和兩個亞型中PDAC樣本的臨床特征

由于免疫細胞在PDAC的發(fā)生和進展中起著重要作用，作者接下來評估了兩個亞型之間浸潤免疫細胞的變化。在亞型2中，單核細胞、靜息型肥大細胞、原始B細胞和CD8 T細胞的水平高于亞型1，而調節(jié)性T細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞M0和活化型肥大細胞的水平低于亞型1。

2. 發(fā)展和驗證與泛素化相關的預后標志

使用“l(fā)imma”程序，在|log fold change (FC)| >1和FDR < 0.05的標準下，在兩個聚類之間找到了996個差異表達基因（DEGs）。隨后，確定了43個與泛素化相關的DEGs，它們在PDAC和正常組織之間的表達水平明顯不同（圖3A、B）。接下來，通過單變量Cox分析找到了12個與預后相關的DEGs。隨后，作者進行了LASSO分析，去除了過擬合的基因，創(chuàng)建了3個基因（SLC22A17、UCHL1和S100A2）的URGs標志（圖3C、D）。

圖3 預后標記的構建

PDAC患者根據(jù)中位風險評分值被分為低風險和高風險兩類（圖3E）。圖3F展示了這兩個基因在兩個風險類別之間的表達變化。此外，風險評分較高的患者有更高的死亡率（圖3G）。此外，作者進行了ROC曲線評估URGs標志，結果顯示1年、2年和3年期間的AUC值分別為0.710、0.706和0.748（圖3H）。

此外，作者在測試數(shù)據(jù)集中驗證了上述發(fā)現(xiàn)。測試數(shù)據(jù)集中的所有PADC患者也被分為低風險和高風險類別。KM分析顯示，與TCGA-test、TCGA-all和ICGC-PACA-AU中高風險患者相比，低風險個體的預后更為有利（圖4A-C）。在TCGA-test中，1年、2年和3年期間的ROC曲線下面積（AUC）值分別為0.738、0.654和0.723（圖4D）；在TCGA-all中，AUC值分別為0.723、0.707和0.704（圖4E）；在ICGC-PACA-AU中，AUC值分別為0.726、0.738和0.759（圖4F）。此外，另一個測試數(shù)據(jù)集GSE57495也用于驗證。高風險評分的患者具有更高的死亡率，1年、2年和3年期間的AUC值分別為0.706、0.733和0.871。

圖4 預后標志的驗證

3. PDAC的列線圖構建

多變量和單變量Cox回歸分析證明風險評分獨立地作為一個強有力的預后標志物（P < 0.05）（圖5A，B）。利用訓練數(shù)據(jù)集中的URG標記和臨床變量開發(fā)了一種創(chuàng)新的圖表，以進一步挖掘URG標記的預后潛力（圖5C）。預測的1年、2年、3年生存率與實際觀察結果接近（圖5D）。此外，進行了ROC分析以評估圖表的預后預測價值。對于1年生存時間，AUC值為0.745，0.731（風險評分）（圖5E）。對于2年生存時間，AUC值為0.776，0.680（風險評分）（圖5F）。對于3年生存時間，AUC值為0.802，0.708（風險評分）（圖5G）。這些結果表明，這種新穎的圖表可以作為一個出色的預后預測模型。

圖5 構建和評估圖表

6. 高風險組和低風險組的腫瘤微環(huán)境分析

TME在腫瘤的生物行為中起著關鍵的指示作用。ESTIMATE分析顯示，高風險類別中的ImuneScores、StromalScores和ESTIMATEScores均較低，與低風險類別相比（圖6A）。ssGSEA分析發(fā)現(xiàn)，高風險患者中B細胞、CD8+ T細胞、DCs、iDCs、中性粒細胞、肥大細胞、輔助T細胞、腫瘤浸潤細胞（TIL）和調節(jié)性T細胞（Treg）的浸潤較低，與低風險患者相比（圖6B）。一些免疫功能，包括T細胞共刺激、CCR、II型干擾素反應和T細胞共抑制，在低風險患者中也得到改善（圖6C）。此外，通過CIBERSORT、MCPCOUNTER、QUANTISEQ、EPIC、TIMER、CIBERSORT-ABS和XCELL還研究了兩個風險組之間免疫細胞水平的差異。根據(jù)研究結果，低風險類別在大多數(shù)免疫細胞中，包括原始CD4 T細胞、CD8 T細胞、DCs、癌相關成纖維細胞、NK細胞、B細胞和單核細胞，水平明顯較高（圖6D）。這可能解釋了為什么低風險類別具有更好的預后。此外，圖6E展示了多個免疫亞型中低風險和高風險個體的分布情況。

圖6 高風險組和低風險組的免疫狀況分析

作者接下來對低風險和高風險患者的免疫相關基因表達模式進行了研究。大多數(shù)免疫相關基因在高風險類別中表達水平較低（圖7A-D）。TIDE分數(shù)是免疫治療反應的重要生物標志物。作者還研究了TIDE分數(shù)與風險分數(shù)之間的關聯(lián)。與低風險類別相比，高風險類別的TIDE分數(shù)較低（圖7E）。此外，與低風險患者相比，高風險患者對免疫治療的反應更好（圖7F）。

圖7 高風險組和低風險組的免疫治療反應評估

7. URG標記的突變和功能評估的比較分析

對高和低URG得分的PDAC的體細胞突變進行了檢查，以充分描述URG得分的病理生物學意義。高URG得分組與低URG得分組相比，體細胞突變頻率更高（94.05％與70.51％）（圖8A，B）。進行了GO、KEGG和DO富集分析，以研究DEGs的潛在生物學作用。因此，GO結果顯示DEGs主要富集于信號釋放、質膜外側和抗原結合（圖9A，C）。KEGG結果表明DEGs主要富集于胰島素分泌、cAMP信號通路和趨化因子信號通路（圖9B）。DO結果表明DEGs主要富集于細胞類型良性腫瘤、腺癌和胰腺疾?。▓D9C）。此外，GSVA表明高風險和低風險PDAC患者之間的許多途徑發(fā)生了實質性改變（圖9D）。

圖8 高風險組（A）和低風險組（B）中的體細胞基因突變

圖9 富集分析

8. 藥物敏感性和風險評分的相關性分析

作者將PDAC患者的風險評分與化療和靶向治療藥物的IC50值進行相關分析，以了解低風險和高風險類別之間藥物敏感性可能存在的差異。17-AAG和PD-0325901的IC50值在低風險組中顯著較高，而Phenformin、Axitinib、AZD8055和TAK-715的IC50值在低風險組中較低（圖10）。

圖10 高風險和低風險組的藥物敏感性分析

9. S100A2的敲除抑制了胰腺癌的惡性生物行為

首先，作者通過RT-qPCR檢測了三個風險基因的表達。結果顯示，胰腺癌組織中三個風險基因的表達高于正常胰腺組織（圖11A）。接下來，作者在PANC-1細胞中敲低了S100A2，以探究S100A2在胰腺癌中的作用。結果顯示，S100A2敲低減少了PANC-1細胞的克隆、遷移和侵襲能力（圖11B-D）。此外，發(fā)現(xiàn)S100A2敲低增加了β-連環(huán)蛋白的泛素化，從而降低了其蛋白表達（圖11E）。這些結果表明，S100A2敲低可能通過增加β-連環(huán)蛋白的泛素化來抑制胰腺癌細胞的惡性生物行為。

圖11 S100A2敲低抑制PDAC細胞的惡性生物學行為

總結

總之，作者設計了一個基于URGs的分子亞型和預后標志，有助于預測生存、指導免疫治療和確定臨床結果。這項研究可能為作者深入了解PDAC中泛素化的功能提供了更深層次的見解，并促進了更有效的治療方法的發(fā)展。