摘要：

組蛋白 H2A 家族證明有很多變異與癌癥發(fā)展相關(guān)。HIST3H2A 與胰腺癌之間的聯(lián)系以前從未被注意到。我們的研究表明，HIST3H2A通過JAK STAT通路影響胰腺腫瘤免疫過程和患者預(yù)后，有望成為胰腺癌的生物標(biāo)志物。

從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫（TCGA）和基因型組織表達（GETx）項目下載胰腺癌患者的基因表達譜和臨床數(shù)據(jù)。使用R軟件（Rx64 3.6.0）進行分析。基因集富集分析 (GSEA) 用于分析胰腺癌中 HIST3H2A 相關(guān)的信號通路。CIBERSORT 用于根據(jù)批量表達數(shù)據(jù)估計 22 種免疫細(xì)胞組分的組成模式。

HIST3H2A 在胰腺癌組織中的表達高于正常胰腺組織。Kaplan-Meier 生存分析表明，HIST3H2A 表達水平影響胰腺癌患者的預(yù)后。單變量 Cox 分析和多變量 Cox 分析表明 HIST3H2A 表達是胰腺癌的預(yù)后因素。Cor表達分析表明，與HIST3H2A表達趨勢呈正相關(guān)的基因為DCST1-AS1、HIST1H2BD、SLC12A9-AS1。GSEA 顯示 JAK-STAT 信號通路在 HIST3H2A 高表達表型中富集，而 IgA 產(chǎn)生、哮喘和趨化因子信號通路的腸道網(wǎng)絡(luò)在 HIST3H2A 低表達表型中富集。此外，結(jié)果顯示 CD8 T 細(xì)胞 (?P?= .007)、活化的 CD4 記憶 T 細(xì)胞 (?P??= .001) 和單核細(xì)胞 (?P??= .002) 在低 HIST3H2A 表達組中更豐富。

HIST3H2A 是一種很有前途的預(yù)測胰腺癌預(yù)后的生物標(biāo)志物，它可能是一個潛在的治療靶點。HIST3H2A 可能通過調(diào)節(jié) JAK-STAT 通路來調(diào)節(jié)胰腺癌中腫瘤免疫的進展。此外，HIST3H2A在胰腺癌中的作用可能與DCST1-AS1、HIST1H2B、SLC12A9-AS1有關(guān)。然而，需要更多的研究來驗證研究結(jié)果。

關(guān)鍵詞：HIST3H2A，JAK-STAT通路，胰腺癌，預(yù)后，治療靶點

簡介

胰腺癌是世界上最致命的惡性腫瘤之一。根據(jù) GLOBOCAN 2012 年的估計，胰腺癌每年導(dǎo)致超過 331,000 人死亡，占所有死亡人數(shù)的 4.0%，使其成為男女癌癥死亡的第 7 大主要原因。患胰腺癌的風(fēng)險隨著年齡的增長而增加，隨著普通人群的不斷老齡化，這種發(fā)病率趨勢預(yù)計會增加。胰腺癌的估計 5 年生存率低于約 5%。[?1?-?3?]目前，胰腺癌的主要治療方法是手術(shù)。由于缺乏可行的篩查方法和早期的特異性癥狀，大多數(shù)患者在晚期發(fā)現(xiàn)并失去了手術(shù)治療的機會。不幸的是，轉(zhuǎn)移性胰腺癌的有效化療選擇很少。此外，其標(biāo)準(zhǔn)治療藥物吉西他濱并未獨立評估或與其他化療藥物聯(lián)合評估對晚期疾病患者的生存率產(chǎn)生積極影響。因此，迫切需要我們進一步深入了解促癌基因和分子因素，尋找有效的生物標(biāo)志物，提高胰腺癌的早期診斷率、治療率和預(yù)測預(yù)后，從而大大延長胰腺癌患者的生命。 .[?3?]

核小體顆粒是真核細(xì)胞中染色質(zhì)纖維的基本單位，其核心由組蛋白H2A、H2B、H3和H4組成。此外，H3 和 H4 中的 2 個單元形成一個被 H2A-H2B 的 2 個二聚體包圍的四聚體。[?4?]細(xì)胞可以通過DNA甲基化、組蛋白變異、組蛋白共價修飾向染色質(zhì)發(fā)送動態(tài)信號，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)，維持基因組完整性。[?5?–?8?]組蛋白有多種翻譯形式，包括乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化。這些修飾調(diào)節(jié)許多信號通路、轉(zhuǎn)錄激活或抑制，[?9?]DNA 修復(fù)，染色體動力學(xué)。[?10?]在真核生物中，H2A、H2B 和 H3 已被證明具有變體，其中一些在真核生物中很常見、高度保守，其中一些在真核生物中特別進化。[?11?]目前，一些研究已將 H2A 的某些變體與癌癥聯(lián)系起來。H2A.Z 被認(rèn)為主要是促腫瘤，而 macroH2A 和 H2A.X 被認(rèn)為是腫瘤抑制因子。[?12?]?H2A.Z 過度表達的頻率與黑色素瘤、[?13?]肝細(xì)胞癌、[?14?]和乳腺癌的不良生存率有關(guān)。[?15?]MacroH2A 已被證明在膀胱癌、黑色素瘤、四核腫瘤、[?16?]和乳腺癌中具有腫瘤抑制作用。[?11?]?H2A.X 基因的缺失和突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的 DNA 損傷，并且與散發(fā)性乳腺癌、[?17?]頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、[?18?]神經(jīng)母細(xì)胞瘤、[?19?]和造血系統(tǒng)惡性腫瘤如慢性淋巴細(xì)胞白血病。[?11?,?20?]s139 磷酸化 H2A.X 是一種很有前途的癌癥風(fēng)險評估、早期檢測、預(yù)后和治療評估的標(biāo)志物，可以定量檢測細(xì)胞和組織中的 DNA 損傷。s139 磷酸化的 H2A.X 與肺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌有關(guān)。[?21?]磷酸化組蛋白 H2AX 現(xiàn)在被認(rèn)為是癌前肝癌的生物標(biāo)志物。[?22?]?盡管近年來關(guān)于經(jīng)典H2A家族的組蛋白變異體和共價修飾與癌癥之間的關(guān)系的研究較多，但由于經(jīng)典H2A序列的變異較小，其與癌癥的關(guān)系研究較少，且其功能意義不大。 H2A 目前還不清楚。

在這項工作中，我們試圖揭示 HIST3H2A 在典型家族中在胰腺癌中表達的重要性。HIST3H2A的表達可能影響胰腺癌腫瘤免疫過程，從而影響胰腺癌患者的預(yù)后。我們比較了腫瘤組織和正常組織之間的 HIST3H2A mRNA 表達并將它們與臨床參數(shù)相關(guān)聯(lián)，然后我們分析了這些數(shù)據(jù)與患者總生存期 (OS) 和無病生存期 (DFS) 之間的相關(guān)性。此外，我們進行了 GSEA 分析和共表達分析，以探索該基因在胰腺癌中的特定分子機制。最后，我們應(yīng)用一種反卷積算法來揭示胰腺癌中 22 個免疫細(xì)胞亞群的比例。

結(jié)果

患者臨床參數(shù)

胰腺癌患者的臨床資料來自TCGA數(shù)據(jù)庫，包括年齡、性別、臨床分期、分類、生命狀態(tài)等（表?1）。

HIST3H2A 在胰腺癌中高表達

通過 Wilcoxon 秩和檢驗，我們比較了 178 個胰腺癌組織和 207 個正常組織。結(jié)果表明，HIST3H2A 在胰腺組織中的表達顯著升高（圖 3）。（圖。1;1;?P??< .001)。

胰腺癌患者HIST3H2A表達與臨床參數(shù)的相關(guān)性

我們通過R軟件（Rx64 3.6.0）分析了HisT3H2A與患者臨床參數(shù)的關(guān)系。Logistic回歸分析結(jié)果表明，胰腺癌患者HIST3H2A表達升高與這些臨床參數(shù)（年齡、性別、臨床分期、T分期、N分期和M分期、生命狀態(tài)）無關(guān)（表（表22）。

HIST3H2A 可能是預(yù)測胰腺癌預(yù)后的獨立危險因素

我們分析了 HIST3H2A 在胰腺癌預(yù)后中的相對風(fēng)險。所有胰腺癌患者均按照 HIST3H2A 表達值中位數(shù)（HIST3H2A 高表達組和 HIST3H2A 低表達組）進行分類。我們排除了沒有完整臨床數(shù)據(jù)的患者。Kaplan-Meier 生存分析沒有意義（圖 1）。（圖 2A）。2一個）。單變量 Cox 回歸分析表明，與 HIST3H2A 低表達的患者相比，HIST3H2A 的高表達與胰腺癌患者的死亡風(fēng)險顯著增加相關(guān)（P??< .05）（表（表3）。3）。一些臨床參數(shù)，如年齡 (?P??< .05)、N 分期 (?P??< .05) 也與胰腺癌的預(yù)后相關(guān)（表（表 4）。4）。多因素 Cox 回歸分析表明，HIST3H2A 可能是預(yù)測疾病預(yù)后的獨立危險因素（P??< .05），年齡（P??< .05）、組織學(xué)分級（P??< .05）、N 分類（P??< 0.05）分別為包括

。

?HIST3H2A相關(guān)胰腺基因組表達的Cor表達分析

為了研究與胰腺癌中 HIST3H2A 表達相關(guān)的基因，我們進行了 cor 表達分析。結(jié)果顯示，與 HIST3H2A 表達趨勢呈正相關(guān)的基因為 DCST1-AS1（P??< .001）（圖 1）。（圖 3A），3A），HIST1H2BD（P??< .001）（圖。（圖 3B），3B), SLC12A9-AS1 (?P??< .001) (圖.（圖33C）。

JAK -STAT 信號通路和腸道免疫網(wǎng)絡(luò)受 HIST3H2A 調(diào)控

為了進一步研究 HIST3H2A 在胰腺癌中的調(diào)控途徑，我們進行了 GSEA 分析（表?（表4）4) 在已發(fā)表的 TCGA 胰腺癌數(shù)據(jù)庫中。我們發(fā)現(xiàn) HIST3H2A 的高表達與 JAK-STAT 信號通路呈正相關(guān)（圖 3）。（圖 4A），4A），而用于產(chǎn)生 IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)（圖 1）。?（圖 4B），4B)、哮喘(圖。?(圖 4C),4C)、趨化因子信號通路(圖1)。?（圖 4D），4D)、甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝(圖1)。?（圖 4E）4E)在HIST3H2A低表達表型中富集，提示該通路可能參與了HIST3H2A的功能。

胰腺癌中免疫細(xì)胞浸潤的情況

為了進一步研究 HIST3H2A在胰腺癌中的腫瘤免疫功能，我們使用 CIBERSORT 算法估計 TCGA-胰腺癌免疫細(xì)胞浸潤狀態(tài)，并比較了較高 HIST3H2A 和較低 HIST3H2A 之間免疫細(xì)胞浸潤模式的差異（圖 1）。（圖 5）。5）。結(jié)果顯示HIST3H2A表達降低。結(jié)果表明，?在 HIST3H2A 表達較低的組中，CD8 T 細(xì)胞 (?P??= .007)、活化的 CD4 記憶 T 細(xì)胞 (?P??= .001) 和單核細(xì)胞 (?P = .002) 更豐富。盡管在 HIST3H2A 表達較高的組中，記憶 B 細(xì)胞 (?P??= .001)、活化的 NK 細(xì)胞 (?P??= .006) 和 M0 巨噬細(xì)胞 (?P??= .002) 顯著較高。這一發(fā)現(xiàn)表明免疫激活細(xì)胞在低 HIST3H2A 表達中顯著豐富，這也鞏固了 GSEA 在低 HIST3H2A 表達表型中的結(jié)果。

討論

JAK STAT 通路介導(dǎo)細(xì)胞因子、干擾素和生長因子的作用，并控制細(xì)胞中的基因表達。它將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的轉(zhuǎn)錄程序中，它還承擔(dān)著額外的功能，參與細(xì)胞核中染色質(zhì)構(gòu)象和表觀遺傳標(biāo)記的調(diào)節(jié)，并影響細(xì)胞質(zhì)、線粒體和細(xì)胞核中的氧化磷酸化.?[?23?]值得注意的是，JAK STAT通路在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。JAKs 和 STATs 的突變會導(dǎo)致免疫缺陷。它導(dǎo)致無功能的T細(xì)胞和有缺陷的免疫球蛋白產(chǎn)生細(xì)胞的出現(xiàn)，從而阻礙了T細(xì)胞、NK細(xì)胞的發(fā)育和B細(xì)胞的功能。STAT3 和 STAT5 活性是人類 T 濾泡輔助細(xì)胞的生成所必需的。（T 濾泡輔助細(xì)胞可以誘導(dǎo) B 細(xì)胞分化并產(chǎn)生抗體。）[?24?]JAK STAT 通路由白細(xì)胞介素 (IL)6、IL10/IL22 和 IL17/IL23 細(xì)胞因子家族成員激活并參與腸道免疫。過度激活 JAK 通路會抑制先天免疫和適應(yīng)性免疫中的腫瘤免疫功能，從而促進惡性細(xì)胞的生長。[?25?]我們的研究表明，HIST3H2A 的高表達與 JAK-STAT 信號通路呈正相關(guān)。此外，通過分析腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤，我們發(fā)現(xiàn)免疫激活細(xì)胞（CD8 T 細(xì)胞和記憶激活 CD4+ T 細(xì)胞）在較高的 HIST3H2A 表達中明顯不足。因此，我們推測 HIST3H2A 可能通過調(diào)節(jié) JAK-STAT 通路來調(diào)節(jié)胰腺癌中腫瘤免疫的進展。在HIST3H2A生存曲線中，前3年趨勢很明顯，但到了晚期趨勢不再明顯，我們認(rèn)為胰腺癌患者往往發(fā)展迅速，存活>3年的患者可能有更強的腫瘤免疫功能由于遺傳因素，它們受HIST3H2A的影響較小。

LncRNA DST1-AS1 的高表達與較差的預(yù)后顯著相關(guān)。LncRNA DCST1-AS1 通過調(diào)節(jié) AKT/mTOR 信號級聯(lián)促進細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡和自噬。[?26?]?HIST1H2BD的高表達與宮頸癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。[?27?]H2A/H2B 在允許轉(zhuǎn)錄、DNA 復(fù)制和 DNA 修復(fù)的染色質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用。SLC12 基因家族編碼電中性無機陽離子氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白，它們是介導(dǎo)無機鈉 (Na+) 和鉀(k+) 陽離子運動的質(zhì)膜蛋白，與氯離子 (cl+) 陰離子的運動緊密耦合。這些轉(zhuǎn)運蛋白在人體生理學(xué)中發(fā)揮著幾個重要作用。SLC12 蛋白家族包括 SLC12A8 和 SLC12A9，它們編碼尚未賦予其功能的蛋白質(zhì)。[?28?]由于對胰腺癌患者HIST3H2A的研究有限，因此HIST3HI2A與這些基因（SLC12A8和SLC12A9）之間的相互作用需要進一步的實驗研究。我們使用生物信息學(xué)方法證明了這些基因的關(guān)聯(lián)，通過影響腫瘤免疫過程進一步影響胰腺癌患者的發(fā)展和預(yù)后。

也就是說，這項研究也有一些局限性。首先，我們只分析了 TCGA 數(shù)據(jù)庫和 GETx 項目，我們的結(jié)果需要在許多外部驗證隊列中進行驗證；應(yīng)該考慮來自不同隊列的批次效應(yīng)來確認(rèn)這些有趣的發(fā)現(xiàn)。其次，我們沒有確定 HIST3H2A 的最佳截止值。在這里，Siglec15 mRNA 表達的中值被認(rèn)為是截止值。在我們的研究中，Kaplan-Meier 生存分析沒有意義。然而，單變量 Cox 回歸分析表明，與 HIST3H2A 低表達的患者相比，HIST3H2A 的高表達與胰腺癌患者的死亡風(fēng)險顯著增加有關(guān)。多變量 Cox 回歸分析還表明 HIST3H2A 可能是預(yù)測疾病預(yù)后的獨立危險因素。最后，需要進一步的實驗來確定 HIST3H2A 的表達譜、JAK-STAT 信號通路和免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。

材料和方法

數(shù)據(jù)庫

數(shù)據(jù)包括 178 個胰腺癌組織和 4 個正常組織，患者臨床信息（包括 futime、fustat、年齡、性別、病理分期和組織學(xué)分級）和 HIST3H2A 表達水平從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載（https ://genome-cancer.ucsc.edu?)。此外，我們將 203 個正常胰腺組織收集到 TCGA 數(shù)據(jù)庫中進行方差分析。

這些數(shù)據(jù)是從公共數(shù)據(jù)庫下載的，因此不適用于額外的道德批準(zhǔn)。

?統(tǒng)計分析

我們通過 R 軟件 (Rx64 3.6.0) 執(zhí)行所有統(tǒng)計分析。首先，我們提取基因表達譜和胰腺癌患者的數(shù)據(jù)，然后我們注釋基因矩陣并刪除臨床信息不完整的患者。其次，我們根據(jù) HIST3H2A 的表達將患者分為 2 組（高和低），并使用 Kaplan-Meier 方法校正表達和患者的 OS 和 DFS。第三，通過Wilcoxon秩和檢驗、Kruskal-Wallis檢驗分析患者生存狀態(tài)與臨床信息的相關(guān)性，然后通過邏輯回歸檢驗各因素的作用。單變量Cox分析用于選擇可能的預(yù)后因素，多變量Cox分析用于驗證HIST3H2A表達與生存率之間的相關(guān)性。

基因集富集分析

我們通過GSEA確定了與HIST3H2A表達相關(guān)的基因集在哪個途徑富集，并通過共表達分析分析了可能的分子間相互作用機制。每次分析進行 1000 次基因組排列。P值<.05和錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05的基因組被認(rèn)為是顯著富集的。

評估免疫細(xì)胞亞型分布

為了從胰腺癌的基因表達譜中量化浸潤免疫細(xì)胞的相對比例，使用一種稱為 CIBERSORT (?https://cibersortx.stanford.edu/?) 的生物信息學(xué)算法來計算免疫細(xì)胞浸潤。使用具有 1000 個排列的 22 種免疫細(xì)胞亞型的參考集估計了推定的免疫細(xì)胞豐度。使用 R 中的“vioplot”包繪制小提琴圖，以可視化較高 HIST3H2A 表達和較低 HIST3H2A 表達之間免疫細(xì)胞浸潤的差異。